ABD活性因子對乳腺癌荷瘤小鼠化療期間營養狀態的影響

文章來源：

《中國腫瘤》 2019 年第 28 卷第 6 期

China Cancer,2019,Vol.28,No.6

作者：

曾珍1 ，杜馳2 ，塗梨1 ，王力1 ，王喻義 1 ，羅鋒1（ 1. 四川大學華西醫院，生物治療國家重點實驗室，四川成都 610041 ；2. 內江市第二人民醫院，四川內江 641000 ）

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤［ 1 ］，在女性人群中發病比例不斷攀升，嚴重影響女性健康。乳腺癌生物學特性基本由雌激素受體（ estrogen receptor ， ER ）、人表皮生長因子受體 2 （ human epidermal growth factor receptor 2 ， HER-2 ）和細胞增殖抗原（ antigen KI67 ， ki67 ）決定。因此 ER 和 HER-2 的靶向治療和化療是乳腺癌最重要的內科治療手段［ 2 ］。三陰性乳腺癌（ triple negative breast cancer ， TNBC ）是一類缺乏雌激素受體（ ER ）、孕激素受體（ progesterone receptor ， PR ），以及人類表皮生長因子 2 （ HER-2 ）表達的乳腺癌亞型，它的發病率佔乳腺癌總體發病率的 15%~20% ［ 3 ］。此類患者的複發和死亡風險明顯高於其他類別。由於缺乏有效靶點，三陰乳腺癌的主要治療方式是化學藥物治療，含蒽環類和紫杉類是其標準治療方案［ 4 ］。因此，提高三陰乳腺癌患者對化療的耐受、改善患者的生存質量與治療療效及患者的預後息息相關。

眾所周知，惡性腫瘤患者的營養狀態與治療的副作用、併發症以及疾病預後密切相關。近期文獻報導顯示，營養免疫狀態降低可作為胰腺癌、胃腸道腫瘤和肝癌的不良預後指標［ 5 ， 6 ］。在三陰性乳腺癌患者中，營養免疫狀態也可影響患者的長期預後［ 7 ］。這些研究都證明了營養狀態是決定患者生存質量的重要指標［ 8 ］。營養不良是惡性腫瘤患者常見的併發症之一，嚴重營養不良導致惡液質的發生［ 9 ］，影響患者的治療耐受、生存質量以及預後。活性乳清蛋白—ABD 活性因子是一種從牛奶中低溫萃取提取，具有多種活性成分的優質蛋白，它可以促進抗氧化劑谷胱甘肽（ GSH ）的生物合成［ 10 ］，具有營養支持和調節免疫的作用。已有研究證實，在胰腺癌荷瘤小鼠模型中，ABD 活性因子可以糾正其營養不良、改善惡病質 ［ 11 ］。但是，尚無研究報導 ABD 活性因子改善三陰性乳腺癌荷瘤小鼠的化療耐受、生存質量、療效及預後。本研究從化療療效、生存質量及生存期的角度證明活性乳清蛋白對三陰性乳腺癌荷瘤小鼠預後的改善作用。

材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM 高糖培養基（ Gibco ），胎牛血清（ Thermo Fisher Scientific ），細胞培養用青—鏈黴素（碧雲天），胰蛋白酶（ Gibco ）， ABD 活性因子（美睿健康產業重慶有限公司），酪氨酸（美睿健康產業重慶有限公司），紫杉醇注射液（揚子江葯業集團有限公司），氯化鈉注射液（四川美大康華有限公司），谷胱甘肽檢測試劑盒（碧雲天）。

1.2 儀器

CO 2 恆溫培養箱（ SANYO ），超凈工作台（蘇州安泰空氣技術公司），細胞計數板（上海求精生化儀器試劑公司），離心機（ Eppendorf ），酶標儀（ BIO-RAD ），天平（上海越平科學儀器製造有限公司），遊標卡尺（上海浦江分析儀器廠），動物實驗器材（成都科華實驗儀器有限公司），小鼠飼養和動物實驗設備（四川大學生物治療國家重點實驗室基因工程小鼠中心）。

1.3 細胞株

鼠源性 4T1 乳腺癌細胞株（中國科學院上海細胞生物研究所，本實驗室常規保存備用）。

1.4 實驗動物

4~6 周齡 SPF 級雌性 BALB/c 小鼠，購於四川大學實驗動物中心。小鼠相關實驗獲得四川大學華西醫院實驗醫學倫理委員會批準（編號 2011-020 ）。

1.5 細胞培養

4T1 細胞使用 10% 胎牛血清和 100U/ml 青—鏈黴素的 DMEM 高糖培養基並放置在 37℃ 、 5%CO2 培養箱中培養。我們選擇對數生長期的 4T1 細胞，使用含 EDTA 的胰蛋白酶進行細胞傳代。

1.6 三陰性乳腺癌小鼠模型建立、實驗分組及營養治療方案

4~6 周齡 BALB/c 雌性小鼠與四川大學動物實驗中心 SPF 級動物房進行隨機分籠適應飼養 7 天。取對數生長期的乳腺癌細胞 4T1 ，使用無血清 DMEM 培養基調整細胞濃度為 1×10 7 /100μl 左右，在小鼠的左側背部皮下接種細胞懸液 200μl 。第 10 天，小鼠背部皮下可觸及腫瘤，進行隨機分組給葯。選擇腫瘤體積一致、形態規則的 BALB/c 小鼠 24 隻，隨機分為 4 組，分別為：空白對照組（ Control 組）、紫杉醇化療組（ Control+ 紫杉醇組）、添加酪蛋白的紫杉醇化療組（酪蛋白 + 紫杉醇組）、添加活性乳清蛋白的紫杉醇化療組（ ABD+ 紫杉醇組）。第二天進行給葯， Control 組小鼠進行腹腔注射氯化鈉注射液 200μl 和飲用滅菌水，其餘組小鼠使用紫杉醇溶液，每次按照 5mg/kg 進行腹腔注射給葯 200μl 。酪蛋白粉和 ABD 活性因子分別加入滅菌飲用水中，濃度為 120mg/ml ，每日換水一次，根據既往試驗和文獻，小鼠一天的飲水量 5ml 左右，保證每隻小鼠的蛋白攝

入量在 600mg 左右。每 2~3 天使用遊標卡尺測量一次腫瘤的長短徑和稱量一次小鼠重量直至出現第一隻小鼠死亡停止記錄，腫瘤體積 =0.5× 長徑 × 短徑［ 2 ］，記錄小鼠的生存時間。另有一批相同處理條件的小鼠，給葯 21 天后處死小鼠，取血測量 GSH 含量。解剖取下腫瘤、稱量並進行拍照記錄。解剖下肺放置於多聚甲醛溶液中拍照記錄轉移瘤數目。

1.7 GSH 含量測定

解剖取下小鼠腫瘤組織，用液氮速凍後研成粉末，加入去除試劑 S 溶液，充分勻漿， 4℃ 放置 10min 後， 10 000g 4℃ 離心 10min ，取上清用於總谷胱甘肽的測定。小鼠眼眶取血所得新鮮血液 600g 離心 10min ，取上清血漿加入去除試劑 S 溶液混勻，冰浴放置 10min 。4℃ ， 10 000g 離心 10min 。取上清用於總谷胱甘肽的測定。上述所得樣品依次加入 96 孔板，加入 150μl 總谷胱甘肽檢測工作液，混勻，室溫孵育 5min 後加入 50μl 0.5mg/ml NADPH 溶液，混勻，反應 25min 後使用酶標儀測定 A410 吸光度。根據不同濃度標準品測得的不同吸光度作出標準曲線。樣品對照標準曲線即可計算出總谷胱甘肽的含量。

1.8 統計學處理

實驗數據採用 SPSS19.0 統計軟體進行分析。統計結果採用均數 ± 標準差（ x± s ）表示，比較組間差異採用單因素分析，組間兩兩比較使用 t 檢驗， P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

結果

2.1 小鼠體重的改變

從第 26 天開始荷瘤小鼠體重出現明顯下降，其中 Control 組下降速度最快，而 ABD 組體重下降速度明顯緩於酪蛋白 + 紫杉醇組和 Control+ 紫杉醇組，至第 31 天 Control 組瘤鼠體重［（ 17.63±1.40 ） g ］低於 Control+ 紫杉醇組［（ 18.71±0.86 ） g ］，但差異無統計學意義（ P =0.196 ）。此時 ABD+ 紫杉醇組瘤鼠體重［（ 20.52±1.10 ） g ］顯著高於酪蛋白 + 紫杉醇組［（ 19.03±1.76 ） g ］（ P =0.006 ）和 Control+ 紫杉醇組（ P =0.003 ）（ Figure 1 ）。

2.2 瘤體積及實驗終點瘤體重量的改變

小鼠皮下接瘤成功後 4T1 腫瘤的體積在第 24 天出現相對平緩增長，而後呈現逐步上升趨勢，ABD + 紫杉醇組較酪蛋白 + 紫杉醇組和 Control + 紫杉醇組腫瘤體積相對平緩增長時間明顯增加。3 周後處死小鼠，測量小鼠腫瘤的體積及重量。實驗終點各組腫瘤重量分別為：ABD+ 紫杉醇組（ 0.64±0.23 ） g 、酪蛋白 + 紫杉醇組（ 0.74±0.26 ） g 、 Control+ 紫杉醇組腫瘤（ 0.80±0.17 ） g 、 Control 組（ 1.41±0.55 ） g(Figure 2~4) 。

2.3 肺轉移瘤數量

試驗小鼠進行試驗 3 周後解剖小鼠的肺組織。觀察各組小鼠肺轉移情況並計數肺表面的瘤結節數(Figure 5) 。其中 Control 組平均轉移數為 8.8 個，Control+ 紫杉醇組為 4.2 個，酪蛋白 + 紫杉醇組為 4.8個， ABD+ 紫杉醇組為 4.0 個。Control 組與 Control + 紫杉醇組對比差異具有統計學意義 ( P =0.015) ；Control 組與酪蛋白 + 紫杉醇組差異具有統計學意義 ( P =0.038) ， Control 組與 ABD + 紫杉醇組差異具有統計學意義 ( P =0.016) 。但是酪蛋白 + 紫杉醇組與 ABD+ 紫杉醇組對比差異無統計學意義 ( P =0.524) 。

2.4 小鼠生存曲線

進行試驗乾預後，記錄各組小鼠的生存時間(Figure 6) 。實驗開始第 33 天 Control 組開始出現死亡。第 34 天 Control+ 紫杉醇組與酪蛋白 + 紫杉醇組分別出現死亡小鼠，而本實驗的 ABD，+ 紫杉醇組直至第 39 天才出現死亡。試驗進行第 50 天 4 組小鼠全部死亡。利用統計學分析（ Log-rank test ），ABD+ 紫杉醇組的生存期較 Control+ 紫杉醇組 ( P =0.035) 與酪蛋白 + 紫杉醇組 ( P = 0.041) 延長存在統計學差異。

2.5 GSH 的改變

在試驗 3 周後，我們分別取小鼠腫瘤和血液進行谷氨醯胺（ GSH ）的測量。腫瘤組織中， ABD+ 紫杉醇組腫瘤的 GSH 含量 [ （ 34.5±18.0 ） μmol/L] 低於酪蛋白 + 紫杉醇組 [ （ 55.3±23.8 ） μmol/L] （ P =0.159 ）和 Control+ 紫杉醇組 [ （ 54.9±11.7 ） μmol/L]（ P =0.067 ）。血液中， Control 組血液的GSH 含量 [ （ 14.3±8.2 ） μmol/L] 與 Control+紫杉醇組 [ （ 15.2±9.7 ） μmol/L] 無統計學差異（ P =0.876 ），此時 ABD+ 紫杉醇組血液的 GSH 含量 [ （ 19.1±0.7 ） μmol/L] 高於酪蛋白 + 紫杉醇組 [ （ 13.0±8.8 ） μmol/L] （ P =0.158 ）和 Control+ 紫杉醇組 [ （ 15.2±9.7 ） μmol/L ） ]（ P =0.393 ）。但是檢驗分析結果顯示，三組小鼠無論腫瘤還是血液 GSH 含量均無統計學意義（ Figure 7 、 8 ）。

討論

惡性腫瘤是一種消耗性疾病，癌症患者體重減輕和營養不良的發生率為 31％~87％不等［ 12 ］。此外，營養不良還與腫瘤的治療手段有關。化療作為腫瘤治療的一種重要手段，最常見的毒副反應是噁心嘔吐［ 13 ］。許多患者自訴化療期間口服食物攝入量明顯減少。長期的營養不良狀態與患者預後不良息息相關—— —降低生活質量［ 14 ， 15 ］、增加治療毒性［ 16 ］、減少生存率［ 15 ］、導致腫瘤局部複發增加［ 17 ］。營養不良導致患者平均住院日增加，整體治療費用增加，經濟負擔加重。然而，在實際臨床實踐中，患者卻很少接受飲食建議，臨床營養治療的比例亦較低。因此，對於接受化療的腫瘤患者，尤其是對於需要接受化療的三陰乳腺癌患者，了解患者的營養狀況［ 18 ］，儘早開始合理的營養乾預有利於提高患者的治療耐受性和依從性、控制

不良反應，提升生活質量，改善臨床預後。

GSH 是谷胱甘肽 S- 轉移酶結合的重要抗氧化劑和輔助因子，是活性氧（ reactive oxygen species ， ROS ）的主要清除劑，參與細胞的氧化還原調節［ 19 ， 20 ］。在抗氧化防禦和細胞凋亡調節中起著重要的作用［ 21 ］。而氧化還原調節已被證實是惡性細胞存活的重要組成部分［ 22 ］。促進細胞氧化還原平衡有利於增加細胞內活性氧和消耗保護性還原代謝物—— — GSH ，導致氧化應激並誘導細胞凋亡從而治療癌症。消耗會加劇氧化損傷並且其補充可以防止氧化損傷。除了氧化還原調節， GSH 還可以參與調節致癌機制、生長增殖、免疫調節、藥物解毒［ 23 ］。乳清蛋白是一種富含支鏈氨基酸、功能性肽、抗氧化劑和免疫球蛋白的功能蛋白，佔總乳蛋白的 20％，成分接近母乳，易於消

化吸收，是臨床營養乾預的最好來源，被稱為「蛋白之王」［ 24 ］。由於它具有高營養品質和快速吸收的特點，乳清蛋白的營養價值被認為高於雞蛋、酪蛋白和大豆蛋白［ 25 ］。由此產生的乳清蛋白各種衍生物（濃縮物，分離物和水解產物）也具有廣泛的生理學特性，包括抗炎、抗氧化、抗癌、免疫調節、降低心血管風險等［ 10 ， 26 ］。活性乳清蛋白（ ABD 活性因子）是乳清蛋白的分離物，從新鮮牛乳中通過低溫萃取而出，蛋白含量遠高於普通乳清蛋白，可達 90% 以上的高生物活性的功能蛋白。

本實驗就是探究活性乳清蛋白對化療期間小鼠營養狀態，以及治療預後的影響。通過實驗，我們可以得出活性乳清蛋白聯合化療對於控制遠處轉移較單純化療無明顯差異，但是，活性乳清蛋白聯合化療可以減緩小鼠體重下降，改善營養狀態，抑製腫瘤體積增長，提高小鼠的生存期。同時活性乳清蛋白可以增加血液中 GSH 含量。通常認為氧自由基的產生是癌發生中的關鍵步驟。除外腫瘤本身，化療也會產生大量氧自由基，對機體造成過氧化損傷［ 27 ］。有報導提示乳清蛋白的膳食補充劑促進合成 GSH 對氧自由基的抑製以及對物質解毒作用可能致使它在一些泌尿生殖系統癌症中的具有抗腫瘤作用［ 28 ］。此外，細胞減少 GSH 消耗可以消除多葯耐葯相關蛋白 MRP1 介導的對長春花生物鹼和蒽環黴素的抗性，從而使化療藥物更容易到達 GSH 耗盡的細胞［ 29 ］，使 GSH 與化療葯聯合表現出協同抗腫瘤作用。GSH 還可以具有保肝、改善皮膚損傷效果和保護神經作用［ 30 ］。已經有動物模型證實 GSH 合成有利於調節氧化損傷和緩解藥物誘導的肝毒性［ 31 ］。GSH 改善化學試劑所引起的皮膚損傷［ 32 ］和化療引起的神經毒性［ 33 ］。

GSH 的這些生物特性可能是本實驗中活性乳清蛋白提高小鼠生存期的重要原因。乳清蛋白增加體內 GSH 水準［ 34 ］，改善接受化療期間患者的營養狀況和免疫力［ 35 ］，達到抗腫瘤的效果。實驗中我們可以觀察到腫瘤組織中 GSH 含量降低。雖然差異無統計學意義，但是活性乳清蛋白組小鼠腫瘤的 GSH 含量低於空白對照組和添加酪蛋白的紫杉醇化療組。GSH 在細胞內合成主要包括兩個步驟：第一，谷氨醯半胱氨酸合成；第二，谷胱甘肽合成，而 GSH 水準又受到自身所合成濃度的負反饋調節。活性乳清蛋白通過將細胞內半胱氨酸轉化為谷胱甘肽，增加細胞內的 GSH 含量。由於增殖的需要，腫瘤細胞中 GSH 的起始濃度較正常細胞明顯增高，對於 GSH 的需求量和消耗也明顯高於正常組織。導致腫瘤細胞對於 GSH 的消耗極為敏感。當乳清蛋白選擇性地增加腫瘤 GSH 水準後，腫瘤組織迅速達到負反饋抑製點加之腫瘤細胞的極具消耗，導致 GSH 含量降低，誘導腫瘤細胞凋亡。這與我們實驗發現的相一致，活性乳清蛋白小鼠的血液中 GSH 含量增加，腫瘤組織的 GSH 含量降低。

綜上， ABD 活性乳清蛋白能夠改善化療期間的營養狀況，促進生成谷胱甘肽，達到抗氧化的作用。同時提高化療耐受性，提高生活質量，延長生存時間，是臨床腫瘤患者進行營養治療的不錯選擇。