蛋白桑：桑葉次生代謝產物研究

摘要 桑葉不僅是家蠶的唯一飼料，而且也是重要的傳統中藥，在我國及其它一些國家被廣為應用。 桑葉具有降糖、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎等多種藥理活性。近年來，對桑葉化學成分進行了不 少研究，從中提取分離到了多種黃酮類、生物鹼類及苯丙素類化合物。 我國是世界上最大的蠶桑生產國。我國有15個桑種4個變種，桑樹在全國各地均有分布，2004 年全國桑園面積約75萬公頃，年產桑葉約l500萬噸。為推動桑葉的綜合利用及其產業化進程，對 桑葉次生代謝產物進行了較為系統的研究。 通過溶劑提取，色譜分離，波譜鑒定，從桑葉中共分離得到21個化合物，鑒定了其中16個化 (口．sitosterol，MOA．6)、苯甲酸(benzoic 苯甲酸(3，4．dihydroxybenzoic 19、24為首次從桑屬植物中分離得到：MOA-3為新天然產物；MOA-23為新化合物。 通過甲醇提取，分光光度法測定，分析了不同季節、不同桑種、不同品種桑葉總黃酮含量的差 異。不同桑種總黃酮含量的比較分析為首次進行。結果表明：1)育71．1秋季葉片總黃酮含景顯著 高於春夏季，並且lo月(霜前)含量略高於11月(霜後)。而實鈷11-6春、秋葉片總黃酮含量差異不 量極顯著的低於其它桑種。3)同屬華桑的不同桑種質，其桑葉總黃酮含量仍然存在明顯差異，含量 最高的為保靖4號(含量為71．67rag／g)，含量最低的為德江15號(含量為44．56mg幢)。除保靖4 號含量特別高以外，其餘種質總黃酮含量差異沒有不同桑種之間那麼懸殊。從這些種質的原產地來 看，同一原產地的種質總黃酮含量相近。4)同屬白桑的不同桑種質，其桑葉總黃酮含量也存在顯著 差異，含量最高的為白桑8號(含量為60．78 mr／g)。除 rag／g)，含量最低的為桑蓮(含量為34．20 白桑8號含量較高以外，其餘種質的含量都較低，開差也不大。5)不同桑種總黃酮含量平均值為 52．96 mg幢，白桑總黃酮含量平均值為44．00mg幢，再次證明 m鮑，華桑總黃酮含量平均值為55．38 了華桑的總黃酮含量較高，而白桑的總黃酮含量較低。

第一章文獻綜述 1．1植物化學成分研究概述 植物來源的天然藥物是藥物的一個重要組成部分。《本草綱目》中記載的天然藥物有1892種， 清趙學敏編著的《本草綱目拾遺》又補充了1021種。隨著生命科學的進步以及人體自身機能調 節系統的不斷闡明，許多內源性生理活性物質正在不斷被揭露出來，在此基礎上人們運用在酶、 受體、細胞、分子乃至基因調控水準上建立起來的新的生物活性測試體系進行廣泛的篩選，還將 會發現更多的天然藥物。 天然藥物之所以能夠防病治病，其物質基礎在於所含有的有效成分，這些成分大多為植物次 生代謝的產物。然而一種天然藥物往往含有結構、性質不盡相同的多種成分，這也給天然藥物的 成分分析和：jⅡ7-帶來了一定的麻煩。在加工生產過程中，要注意設法除去那些無用的雜質，以得 到富集有效成分的製劑，甚至直接得到這些有效成分的純品。 運用現代科學理論與方法研究天然藥物中化學成分的學科就是天然藥物化學，其研究內容包 括各類天然藥物化學成分(主要是生理活性成分和藥效成分)的結構特點、物理化學性質、提取 分離方法以及主要類型化學成分的結構鑒定知識等，此外，還涉及主要類型化學成分的生物合成 途徑等內容。

1．1．1化學成分的提取 從天然藥物中分離出所含的有機化學成分，國外文獻一般記載．系以瑞典藥劑師、化學家舍 勒(K．W 端。後來，舍勒又用類似的方法從天然物中得到了苯甲酸、乳酸、蘋果酸、沒 食子酸等有機酸類物質。 提取天然活性成分的方法有溶劑法、水蒸氣蒸餾法及升華法等，後兩種方法的應用範圍十分 有限，大多數情況下是採取溶劑提取法。一般而言，植物成分中，萜類、甾體等脂環類及芳香類 化合物因為極性極小，易溶於氧仿、乙醚等親脂性溶劑中；而糖苷、氨基酸等成分則極性較大， 易溶於水及含水醇中：至於酸性、鹼性及兩性化合物，因為存在狀態(分子或離子形式)隨溶液 而異．故溶解度隨pH而改變。 由於存在多種成分間的相互助溶作用，實際情況往往比較複雜，一般是按極性遞增方式，用 不同溶劑。如石油醚或汽油(可提出油脂、蠟、葉綠素、揮髮油、遊離甾體及三萜類化合物)、 氯仿或乙酸乙酯(可提出遊離生物鹼、有機酸及黃酮、香豆素的苷元等中等極性化合物)、丙酮 或乙醇、甲醇(可提出苷類、生物鹼鹽以及鞣質等極性化合物)及水(可提取氨基酸、糖類、無 機鹽等水溶性成分)依次進行提取，得到的各個餾分再做進一步分離。

1．1．2化學成分的分離 根據物質溶解性差別進行分離 主要方法有以下幾種： ①改變溶解度 常常利用溫度不同引起溶解度的改變以分離物質，如結晶、重結晶等。 ②改變溶液極性 一般是在溶液中加入另一種溶劑以改變混合溶劑的極性，使一部分物質沉澱出來，從而實現 分離。例如在濃縮水提液中加入數倍量高濃度乙醇，以沉澱除去多糖、蛋白質等水溶性雜質(水 ／醇法)；或在濃縮乙醇提取液中加入數倍量水稀釋．放置以沉澱除去樹脂、葉綠素等水不溶性雜 質(醇，水法)。 ③改變溶液pH值 對酸性、鹼性或兩性有機化合物來說，常可通過加入酸、鹼以調節溶液的pH值，改變分子 的存在狀態(遊離型或解離型)．從而改變溶解度而實現分離。比如在酸性水提液中加入鹼調至 鹼性可使生物鹼沉澱析出。 ④鹽沉 酸性或鹼性化合物還可通過加入某種沉澱試劑使之生成水不溶性的鹽類等沉澱析出。比如生 物鹼可做成苦味酸鹽、苦酮酸鹽等有機酸鹽。得到的有機酸鹽沉澱懸浮於水中，加入無機酸，使 有機酸遊離後先用乙醚萃取除去，然後再進行鹼化、有機溶劑萃取，回收有機溶劑即可得到純化 了的鹼性有機化合物。 2) 根據物質在兩相溶劑中的分配比不同進行分離 ①簡單液一液萃取法 ②逆流分溶法(CounterCurrentDistribution，CCD) 一般分配因子13>50時，簡單液一液萃取即可解決問題。而13<50時，則宜採用逆流分溶法。 CCD法是一種多次、連續的簡單液—液萃取分離過程。此法操作條件溫和、樣品容易回收，特別 適合於中等極性、不穩定物質的分離。但樣品極性過大、過小．或分配係數受濃度或溫度影響過 大時不宣採用此法分離；易於乳化的溶劑萃取單元系統也不宜採用。 ③液一液分配柱色譜 這是由逆流分溶法發展而來的一種分離方法。將兩相溶劑中的一相塗覆在矽膠等多孔載體上 作為固定相填充在色譜管中，然後加入與固定相不相混溶的另一相溶劑(流動相)沖洗色譜柱． 物質就在兩相溶劑相對作逆流移動過程中不斷進行動態分配而得以分離。 Counter Current ④液滴逆流色譜法(Droplet Chromatography,DCCC) 由液一液分配色譜發展而來。可使流動相以液滴形式垂直上升或下降，通過固定相的液柱， 實現物質的逆流色譜分離。 CounterCurrent ⑤高速逆流色譜(High-speed Chromatography,HSCCC) 是一種不用任何固態載體或支撐體的液液分配色譜技術。HSCCC技術分離效率高、產品純 度高、不存在載體對樣品的吸附和粘染．具有製備量大和溶劑消耗少等優點。1994年，HSCCC 2 技術創始人Y 的分離克數量級樣品，更有利於化學成分的分離製備。 3) 根據物質的吸附性差別進行分離 在天然有機化合物分離與精製過程中，吸附現象利用得十分廣泛。其中又以固．液吸附用得最 多，並有物理吸附、化學吸附和半化學吸附之分。物理吸附(physicalabsorption)也叫表面吸附， 是因構成溶液的分子(含溶質及溶劑)與吸附劑表面分子的分子間力的作用所引起。特點是無選 擇性，吸附與解吸附過程可逆，且可快速進行，故在實際工作中用得最廣。 ①矽膠柱吸附色譜 這是實際工作中用得最多的一種分離方法。能用於非極性化含物，也能用於極性化合物，可 適用於芳香油、萜類、甾體、生物鹼、強心甙、蒽醌類、酸性、酚性化合物、磷脂類、脂肪酸、 氨基酸等。矽膠用量一般為樣品量的30～60倍，樣品極性較小、難以分離者，矽膠用量可適當提 高至樣品量的100～200倍。裝柱和溶解樣品應盡量選用極性小的溶劑，以利樣品在柱上形成狹窄 的原始譜帶。 ②聚醯胺吸附色譜 聚醯胺吸附屬於半化學吸附，是一種用途十分廣泛的分離方法，特別適合於分離酚類、醌類、 黃酮類化合物。此外，對生物鹼、萜類、甾體、糖類、氨基酸等其它極性與非極性化合物的分離 也有著廣泛的用途。聚醯胺對鞣質的吸附特強，近乎不可逆，故也可用於植物粗提物的脫鞣處理。 聚醯胺色譜柱分離時，通常用水裝柱，樣品也儘可能作成水溶液上柱，以利聚醯胺對溶質的充分 吸附，隨後用不同濃度的含水醇洗脫，並不斷提高醇的濃度，逐步增強從柱上洗脫物質的能力。 4) 根據物質分子大小差別進行分離 常用有透析法、凝膠過濾法、超濾法、超速離心法等。前兩者系利用半透膜的膜孔或凝膠的 三維網狀結構的分子篩過濾作用：超濾法是利用因分子大小不同而引起的擴散速度的差別：超速 離心法則是利用溶質在超速離心作用下具有不同的沉降性或浮遊性。 凝膠過濾法(gel 但可膨脹的球形顆粒，具有三維太空的網狀結構。當在永中膨脹後裝入色譜柱中，加入樣品混合 物，用同一溶劑洗脫時，由於凝膠網孔半徑的限制，大分子將不能滲入凝膠顆粒內部。故在顆粒 間隙移動，並隨溶劑一起從柱底先行流出；小分子因可自由滲入井擴散到凝膠顆粒內部，故通過 色譜柱時，阻力增大、流速變緩，將較晚流出。樣品混合物中各個成分因分子大小各異，滲入至 凝膠顆粒內部的程度不盡相同，故在經歷一段時間流動並達到動態平衡後，即按分子由大到小順 P)、瓊 Bio．Gel 脂糖凝膠(sepharose 膠(QAE．sephadex)等結合了不同離子交換基團的葡聚糖凝膠衍生物。 5) 根據物質解離程度不同進行分離 中國農業科學院博士學位論文 第一章文獻綜述 天然有機化合物中，具有酸性、鹼性及兩性基團的分子，在水中多呈解離狀態，據此可用離 子交換法或電泳技術進行分離。 離子交換法是用得較多的一種方法。以離子交換樹脂作為固定相，用水或含水溶劑裝柱。當 樣品水溶液通過交換柱時，溶液中的中性分子及與離子交換樹月＆上的交換基團電荷相反的離子將 通過柱子從柱底流出，而那些與樹脂上交換基團電荷相同的離子將與樹脂上的交換基團進行離子 交換，並被吸附到柱上，隨後改變條件，並用適當溶劑從柱上洗脫下來，即可實現物質分離。根 據交換基團的不同，離子交換樹脂可分為強酸性陽離子交換樹脂、弱酸性陽離子交換樹脂、強鹼 性陰離子交換樹脂、弱鹼性陰離子交換樹脂。 6) 幾種新方法 Fluid Extraction，SCFE) ④超臨界流體萃取(Supercritical 是一種以超臨界流體(SCF)代替常規有機溶劑對目標組分進行萃取和分離的新技術．其原 理是利用流體(溶劑)在l|缶界點附近某區域(超臨界區)內與待分離混台物中的溶質具有異常相 平衡行為和傳遞性能，且對溶質的溶解能力隨壓力和溫度的改變而在相當寬的範圍內變動來實現 分離的。利用SCF作溶劑，可以從多種液態或固態混合物中萃取出待分離組分。由於C02具有 無毒、不易燃易爆、價廉、臨界壓力和溫度較低、易於安全地從混合物中分離出來等優點，所以 的化合物，幾乎保留產品中全部有效成分，無有機溶劑殘留．其產品純度高。 ②超濾膜分離 是一種以多孔性半透膜為分離介質的膜分離技術，具有分離不同分子量分子的功能。其特點 是，有效面積大、濾速快、不易形成表面濃差極化現象、無相態變化、低溫操作、破壞有效成分 的可能性小、能耗低等。 ③大孔吸附樹脂分離 大孔吸附樹脂是吸附性和分子篩性原理相結合的分離材料，吸附性是由於范德華力或產生氫 鍵的結果，分子篩性是由於其本身多孔性結構的性質所決定。因其理化性質穩定，不溶於酸、鹼 及有機溶劑，所以在天然化合物的分離與富集工作中被廣泛應用。樣品一般用水溶液上柱，洗脫 時根據吸附作用強弱不同選用不同濃度的甲醇、乙醇等含水溶劑，直至純的甲醇、乙醇，乃至丙 酮、乙酸乙酯等。對非極性大孔樹脂，洗脫劑極性越小，洗脫能力越強。對於中等極性的大孔樹 脂和極性較大的化合物來說，則以選用極性較大的溶劑為宜。

1．1．3化學成分的結構鑒定 結構研究是植物化學成分研究的一項重要研究內容。從植物中分離得到的單體即使具有很強 的活性與較大的安全性，但如果其結構不清楚，則無法進一步開展其藥效學和毒理學研究，也不 可能進行人工合成或結構修飾、改造工作，更談不上進行高品質的新葯開發研究。 近年來新技術的應用，特別是核磁共振譜與質譜的應用，有力的促進了結構鑒定工作的開展。 綜合運用紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜與質譜能夠迅速準確地定出一個化台物的分子式、結 4 中國農業科學院博士學位論文 第一章文獻綜述 構類型．有些簡單化合物則可直接鑒定出全部結構，且用量在毫克乃至微克水準。 1) 質譜(Mass Spectrograpby,MS) 質譜是記錄分析樣品在質譜儀中經高溫氣化，在離子源受一定能量衝擊，失去電子，生成陽 離子，而後在穩定磁場中按品質與電荷之比(m／z)順序進行分離，通過檢測器而記錄的圖譜。 每個峰代表一個品質數。一般可根據質譜提供的分子離子峰的碎片峰的質荷比確定分子量與推導 結構。根據分子離子峰(通常在最高處，即圖譜的右邊)配合元素組成的分析值，或利用它的同 位素峰的比例(離子峰後l～4位以內)，確定分子式，其它各峰是碎片峰，峰高代表離子的相對 含量。 由於在一定條件下化合物的開裂還遵循一定規律，故比較樣品與標準品在同一裝置、同一條 ionization，E1)、化學電離(chemicalionization，cI)、場致電離(field impact atom 析電離(fielddesorptionionization，FD)、快速原子轟擊電離(fast ionization，ESI)等法， 霧電離(electrospray 2) 紅外光譜(Infrared Spectra，IR) 4000～1500 cm。的區域為特徵頻率區(functionalregion)，許多特徵官能團如羥基、氨基以 group print 1500-625cm。的區域為指紋區(fingerregion)，其中許多吸收因原子或原子團間的鍵角變化 所引起，形狀比較複雜，猶如人的指紋，可據此進行化合物的真偽比較鑒別。 3) 紫外一可見吸收光譜(Ultraviolet-visible Spectra，UV-vis) uV光譜對於分子中含有共軛雙鍵、Ⅱ，8-不飽和羰基醛、酮、酸、酯結構的化合物以及芳香 化合物的結構鑒定來說是一種重要的手段。通常主要用於推斷化合物的骨架類型；某些場合下， 如香豆素類、黃酮類化合物的uv光譜在加入某種診斷試劑後可因分子結構中取代基的類型、數 目及排列方式不同而改變，故還可用於推斷化合物的精細結構。 4) 核磁共振譜(Nuclear Resonance，NMR) Magnetic 方法。近年來發展起來的二維核磁共振(2D-NMR)由於信號相對較簡單，圖象解析比較容易， 在實際測定工作中取得了很好的效果。 5) 旋光光譜(OpticalRotatoryDispersion，ORB) 來確定未知化台物的立體結構。

1．1．4化學成分的合成 1) 生物合成 研究相關化學成分的生物合成，不僅對次生代謝產物進行結構分類或者推測其結構有所幫 助，而且對植物化學分類學及仿生合成等學科都有重要的理論指導意義，對採用組培進行次生代 謝產物的生產也有實際指導意義。主要的生物合成途徑有以下幾種： ①醋酸一丙二酸途徑(Acetate-malonate pathway,AA-MA途徑) 脂肪酸類(fattyacid)、酚類(phenolic 一途徑生成。 acid ②甲戊二羥酸途徑(Mevalonlc pathway,MVA途徑) 萜類(terpenoids)、甾類(steroids)物質由這一途徑生成。 acid acid ③桂皮酸途徑(Cinnamicpahway)及莽草酸途徑(Shikimicpathway) 脫去氨後生成的桂皮酸而來。 acid ④氨基酸途徑(Amino pathway) 生物鹼類成分均由此途徑生成。有些氨基酸脫羧成為胺類，再經過甲基化、氧化、還原、重 排等一系列化學反應後即轉變成為生物鹼。 ⑤復台途徑 有些結構複雜的次生代謝產物，其分子中各個部分不可能來自同一生物合成途徑，比如查爾 酸．丙二酸一莽草酸途徑、醋酸．丙二酸一甲羥戊酸途徑、氨基酸～甲羥戊酸途徑、氨基酸一醋酸． 丙二酸途徑、氨基酸一莽草酸途徑等。 2) 細胞培養生產次生代謝產物 天然活性物質大都為植物體內的次生代謝產物，它們是細胞生命活動或植物生長髮育正常進 行的非必需化台物，其產生和分布通常有種屬、器官、組織及生長髮育時期的特異性，並且其含 量往往不是太高。從天然植物中提取這些活性物質，往往會導致對野生植物的盲目採集，加劇生 態環境的破壞。而採用化學合成，其工藝流程較複雜，並且易產生同分異構體。 近年來發展起來的細胞大量培養生產植物次生代謝產物，不僅可以通過誘變、細胞工程或基 因工程等技術篩選高產細胞株，可以將某種前體或價值較低的化合物轉化成價值較高的化合物， 通過代謝的調控探索新的生物合成路線並獲得新的活性物質，而且能迅速實現規模化生產天然活 分紫草寧(shikonin)、抗腫瘤有效成分紫杉醇(tax01)等天然活性物質。 1．2桑樹次生代謝產物研究進展

1．2．1 桑葉不僅可用作家蠶的飼料．而且作為一種發散風熱葯在我國醫藥中廣泛應用。桑葉始載於 《神農本草經》，列為中品，歷代本草均有收載。桑葉苦、甘、寒，歸肺、肝經，具有疏散風熱、 elal， 清肺潤燥、平肝明目、涼血止血之功效(高學敏，2000)。由於桑葉具有降糖降脂(AndaIIu etal，2000。2001)、抗腫瘤(Kimetal，2000： elal，2002)、抗氧化(Doi 2001．2002，2003；Jang Masudaet 行了長期研究，從中提取分離鑒定出多種化合物。 1) 黃酮類成分(Flavonoids，圖1) 近年來，從桑葉中提取到了多種黃酮類化合物。BasnetP等(1993)通過活性追蹤，發現美 +I生(hypoglycemic SY等(1999)從白桑(Morusalba)葉片中也分離到了1和2兩種化 glucopyranoside，2)。Kim R1=HR2=HR3=GIc 10 R1=R2=HRa=CH3 R·=OHR2=HR3=GIc 11 R1=CH3R2=R3=H R一=H R2=HR3=AeeIyl·GIc 12 R1=R2=GIcR3=CH3 R1=OHRz=HRa=Acetyt—GIc R·=H R2=HRa=Rha(1—6)GIc R-=OH Rz=HR3=Rha(1—61GIc R-=OH R2。H Ra=GIcfl—娟)GIc R1=OH R3=GIc R2=GIc R1=OH R2=HRa=H 圖1 桑葉中幾種黃酮類化台物的結構 Thestructuresoftheflavonoidsfrom leaves Fig．1 mulberry 7 生物鹼類成分(Alkaloids，圖2) 桑樹生物鹼的研究始於日本的農業化學專家，他們在1976年從桑根皮中提取到了l-脫氧野 etal，1976)。至今，已從桑樹中分離到約30種生物鹼，但多數由 尻黴素，即moranoline(Yagi 根中獲得。此類化合物大多具有糖苷酶抑製劑活性。AsanoN等(1994)從山桑(Morus bombycis Koidz．)葉中提取到了7種多羥基生物鹼(polyhydroxylated S等 (1998)也從桑葉中分離得到16。 ， I多N＼ H蜮1 H裰HOCH， pH瓣H … RH， 瓣H冷№ ^H V 13 R1=H R2=OH 17 R=H 19 14 R2=OH 18 R=Gle RI_CH3 15 R1=H R2=O—Gal 16 RI=H R2=H 圖2桑葉中幾種生物鹼類化台物的結構 Thestructuresofthealkaloidsfrom leaves Fig,2 mulberry 3) 苯丙素類成分(Phenylpropanoids，圖3) 根中獲得，尤其是在病原侵染或紫外等環境壓力的情況下累積較多，這類苯並呋喃型化合物可能 與桑樹的抗性和防疫機制有關。Basnet M， 20)、桑辛素M．3。-O-p-D．吡喃葡萄糖苷(moracin (mulberrofuranU，22)。SharmaR等(2001)從桑葉中分離到了以前在桑根或桑皮中分離到的 moracinC(23)．moracinN(24)和ehaleomoraein(25)。LeeSH等(2002)通過對酪氨酸酶活 性抑製作用的生物活性追蹤，從桑葉中分離到桑苷F(mulberrosideF)，即桑辛素M一6，3"-二-D．伊D- 吡喃葡萄糖苷(moraein K等(2001)從桑葉中提 M-6，3"-di。0胡．D．舀ueopyranoside，26)。而Doi 取到香豆素類化合物東莨菪苷(seopolin，27)、茵芋苷(skimmin，28)。桑葉中幾種苯丙素類化台物的結構 Thestructuresofthe from leaves mulberry Fig．3 phe「ylpropanoids R‖$ 圖4桑葉兩種甾體類化合物的結構 The ofthesteroidsfrom leaves Fig．4 structures mulberry 9 中國農業科學院博士學位論文 第一章文獻綜述 5) 其它成分(圖5) acid，31)。 II，32)和苯甲基-D-吡喃葡萄糖 DoiK等(2001)從桑葉中提取到了長春花糖苷II(roseoside 苷(benzyl．D．glucopyranoside，33)。Ratanapo 脂糖柱層析、聚丙烯醯胺葡聚糖Sephacryl 層析、葡聚糖Sephadex 量16500的亞基。 H H H。 唚 ‖ ∞卜目囝 31 33 圖5桑葉中幾種其它類型化台物的結構 Thestructuresoftheother from leaves Fig．5 mulberry compounds

1．2．2桑根 物(aqueousmethanolic kD， 20K。對其氨基酸組分的分析表明，象胰島素一樣，其絲氨酸和半胱氨酸的含量超 命名為Moran 21858D。 KoHH等(1997)從雞桑(MorusPoir．)根皮中分離到了一種異戊二烯基黃酮類物 bombycis 12．e11．28．iocacid。同時還分離到桑根皮素(morusin)、桑皮酮C(kuwanoll acid)等7種已知化合物。 acid)、口香樹素(fl-amyrin)、槲皮素、熊果酸(ursolic AsanoN等(1994)從白桑(Mor「salba (N．containing 物鹼(polyhydroxylatedpiperidine 10 propionamide)和另外15種多羥基生物鹼(Asano D、kuwanonH、mulberrofuranK、kuwanonG、mulberrofuranG等 離到morusin、mulberrofuran 六個成分，並製備了它們的乙醯化合物和葡萄糖甙。DuJ等(2003)從桑白皮中分離到一種異戊 二烯基黃酮moralbanone及另外七種己知化合物桑酮S(kuwanon B 環桑根皮素(cyclomorusin)、eudraflavone (oxydihydromorusin)、leachianone 以平喘、利尿作用為藥效學指標，從桑白皮中分離得到三個化合物，根據理化性質和光譜分析鑒 定為6，甲氧基．7．羥基．香豆素、B．谷甾醇和5，7-羥基香豆素，其中6．甲氧基．7．羥基．香豆素為桑白 皮平端、利尿有效成分。 賈立革等(1996)從華桑(Morus acetate)、 性質及波譜分析分別鑒定為：*香樹脂醇(a-amyrin)、∞香樹脂醇乙酸酯(d．amyrin (3盧，13a，1鄰，17a)．7，24-二烯-3-乙醯羊毛甾醇(butyrospermyl 13a、14口、17a)，7，24．二烯．3．乙醯羊毛甾醇為首次從該屬植物中分離得到。 Fukai hydroxyflavanones)桑根酮醇F、G、I(sanggenolF，GI)，同時還提取到了脫氫桑根酮醇F (dehydrosanggenol J)、 H)及一種新的3- K)。 羥基黃酮桑根酮醇K(sanggenol Shen R等(2001)從華桑根皮中分離到了與桑根酮sanggenonC及O相似的兩種天然 B的絕對 cathayanonA的結構已得到x射線晶體圖分析結果的確證。cathayanonA和cathayanon O。 在2』．和3．位間形成醚鍵而產生的Diels-Alder型加台物sanggenon

1．2．3桑枝、桑果 P等(2001)用narrow-boreHPLC／ESI-MS法從黑桑(MormLinn．)的桑果中提 Dugo nigra 取到了5種花色素苷(anthocyanins)。Asano 基(CM)纖維素離子交換層析，提取並純化得到三種植物凝集素。通過聚丙烯醯胺圓盤凝膠電 中國農業科學院博士學位論文 第一章文獻綜述 含有的是葡萄糖和甘露糖，MsL-2、MSL．3含有的是半乳糖。 徐亞明等(1994)以Fusarium 菌活性追蹤．溶劑萃取得乙酸乙酯部位，進一步反覆柱層析和製備薄層層析得到四個植物防衛素 C，Moracin N。 成分，其中三個經波譜解析和文獻對照，證明為Moracin G和Moracin KoHH等(1999)從雞桑皮中分離到一種新的成分雞桑酮B(australoneB)，並通過光譜學 4-0廿D—glucopyranosyl macroura SG等(2001)從光葉桑(Morus fagomine為首次從桑屬植物中分得。Sun Miq．)皮中提 取到兩種新苯並呋喃macrourinsA和macrourins 提取液的乙酸乙酯部分分離到六個個化合物：enchrenonea7、桑辛素P(moracinP)、3， K、mulberrofuran 5-dimethoxy-p-hydroxybenzylalcohol、mulberrofuran enchrenone 中分離得到五個三萜化合物：a—arayrinacetate、gult-5一en-313-yl en-28-oic acetate。這5個化合物均為首次從 acid、313一hydroxylup-12-en-28一oicacid、butyrospermol 桑樹中得到。 趙桂華等(2001)對生長不同時間的老、嫩、幼桑枝進行了總黃酮含量的測定和薄層分析比 較，結果表明，老、嫩、幼桑技總黃酮含量相近．而幼枝總黃酮含量較低，其薄層色譜圖前二者 完全一致，後者黃酮點明顯減少，以上結果說明傳統選用一年生的剛木質化的嫩枝入葯是有道理 的，而二年生的老枝中雖然黃酮成分含量與嫩枝相近，但由於徑粗，木質較硬，給飲片加工帶來 困難，而剛長出的幼枝中黃酮含量較低，常不採用。

1．2．4其它 multicaulis F及mulberrofuranG並測定了其結構。FerrariF等(2000)從魯桑(MorusPen"．)中提 取到了一種新的Diels．Alder型加合物multicaulisin。Shi YQ等(2001)從蒙桑(Morusmongolica L被認為是一分子脫氫銑牛兒基 Schneid．)中分離到一種新的吡喃黃烷酮sanggenolL，sanggenol M、四種帶有異戊二烯基的2-芳基苯並呋哺 Diels．Alder型加合物，同時分離到的還有sanggenol (2．arylbenzofurans)化合物mulberrofuransW-Z和另外10種已知的黃酮化合物，並通過光譜學 C或其類似物通過酶促 具有降壓作用的活性物質。這些化合物是由查爾酮及dehydro．kuwanon 12 中國農業科學院博士學位論文 第一章文獻綜述 chalcomoracin及kuwanon 同時位和不同器富之間表現較大差異，有成熟葉>嫩時、韌皮部>木質部、細根>鬚根以及葉片> 新梢>根系的傾向。ObH等(2002)通過自由基清除活性追蹤，從桑乙醇提取物中分離到 ether、cudraflavone B、cudraflavone 5，7-dihydroxycoumarin-7一methyl 二烯基黃酮。

1，2，5組織培養合成桑樹次生代謝產物 Kulkarni DD等(1970)首先開展了從桑愈傷組織中分離盧谷甾醇的研究。NomuraT(2001) 發現象雞桑、臼桑等一些桑樹品系的愈傷組織具有chalcomoracin及kuwanonJ等桑樹Diels。Alder 型加合物的高生產能力。為研究桑愈傷組織中的異戊二烯類黃酮的類異戊二烯生物合成，Nomura 型反應的粗酶組分。 Vitali 黑桑(MorusnigraLinn．)細胞懸浮培養物中，24小時後很容易地從代謝提取物中分離到了目標 derivative)的產率可達85％。 化合物，優化後的轉化，異戊二烯基衍生物(prenyl 受到甲羥戊二酸單醯CoA還原酶(hyaroxymethylglutaryl·CoA 桑樹基因組中克隆到一個基因mahmg』。並研究了其在桑樹及轉基因煙草中的表達。在桑樹中， 及根的延長區得到了表達。這為通過基因轉化技術篩選高產細胞系生產異戊二烯類次生代謝物進 行了前期研究。 1．3桑樹藥理作用研究進展 藥理學研究表明，桑葉或其提取物具有多種藥理活性。桑葉可降低血清總膽固醇、甘油三酯、 血漿遊離脂肪酸、低密度脂蛋白一膽固醇、極低密度脂蛋白一膽固醇、血漿過氧化物及尿過氧化 物的濃度。具有明顯的碎糖降脂作用(AndaIluel「，200"／)：桑時提取物對超氧離子自由基具有 桑葉中提取出的黃酮類物質對人早幼粒細胞白血病細胞系HL一60的生長有顯著的抑製效應，具有 明顯的抗腫瘤活性(Kimetal，2000)。據文獻記載，桑葉注射液對小鼠的急性毒性很小，用10％ 桑葉注射液以人用量的60倍(成人用量每次5mL肌注)連續給小鼠腹腔注射21天．對內臟器 中國農業科學院博士學位論文 第一章文獻綜述 有抗菌抗病毒作用，桑色素體外對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌和傷寒桿菌有較強的抑製作用；桑 色素對鼠傷寒沙門菌有明顯的致突變作用；桑色素對兔有利尿作用；對大鼠可抑製醛糖還原酶： 對治療糖尿病性自內障有利；淋巴細胞轉化率低的患者，服用桑枝煎劑兩月，可提高轉化率(宋 立人等，2001)。桑根中提取的桑黃酮G及H、桑葛酮C及D、全部的桑白皮索都具有降壓作用， 化學成分的生物活性及藥理學研究取得了很大進展。

1．3．1對血糖血脂的影響 早在70年代，Gulubova pancreas)序細胞的影響，結果發現最明顯的變化來 (parenteral)處理對兔內分泌腺(endocrine 源於慢性試驗(chronic 不同程度的脫粒(degranulation)現象。 Basnet P等(1993)發現美洲桑葉片的乙酸乙酯(ethyl activity)。 Chert mg／kg，200mg／kg) 體內芸香鹼(pilocarpine)誘導的唾液分泌的增強影響，結果發現提取物(100 顯著增強芸香鹼誘導的唾液流動，但並不增加其中的蛋白組分，而六種化合物 對芸香鹼誘導的唾液分泌的增強與其抗高血糖效果是相關的。陳福君等(1996)將從桑葉中提取 鼠有顯著的降血糖作用。TPM還可提高糖尿病小鼠的耐糖能力，增加肝糖元含量而降低肝葡萄糖。 導的不發胖的糖尿病鼠(1iOn．obesediabeticmice，NODmice)，兩種提取物分別能降低血糖水準 Io％}D 果糖胺極顯著降低。 Chen (中國及日本)及桑根皮(中國)的熱水提取物都有降血糖作用，而桑葉的熱水提取物顯示了更 強的降血糖效果，桑葉及桑根皮提取物中不溶於酒清的組分具有最強的效應，其對未禁食小鼠的 ±5．8％。並提出葡萄糖吸收的增加是桑葉中水提物及不溶酒精組分降血糖作用的一種機制。Kim kDa的桑糖 Es等(1999)發現，在STZ誘導的高血糖鼠模式中，從桑根中提取到分子量約為20 蛋白(Moran20K)能降低血液中葡萄糖水準，還能增加培養的尉睾脂肪細胞中葡萄耱的運輸。 對因葡萄糖所致的大鼠離體胰島(pancreatic mmol／L葡萄糖 mmol／L的濃度就顯著地增強了由10 表明，從桑樹中分離到的fagomine在高於1 mmol／L時胰島素的基礎分泌，同時其對葡萄糖 誘導的胰島素分泌，但並不影響葡萄糖濃度為3．5 mmol／L)還 濃度為10mmol／L及20mmol／L時的胰島索分泌的影響並無顯著差異。Fagomine(4 能增強由甘油醛誘導的胰島素分泌，但並不影響亮氨酸誘導型。從葡萄糖而來的乳酸產量標誌的 糖酵解被顯著地增強，胰島中，由20mmol／L葡萄糖起始的糖酵解上半部反應的所有中間產物(從 6．磷酸葡萄糖到3．磷酸甘油醛)的數量並不被4 酸循環的ATP／ADP比率的提高是葡萄糖及甘油醛誘導的胰島素分泌的關鍵。但是三羧酸循環中 S 等認為，蕎麥鹼對葡萄糖誘導的胰島素分泌的增強是在糖酵解中3-磷酸甘油醛生成後若乾步驟加 elal，1998)。 速的結果(Taniguchi 以桑葉的蠶體內濃縮了2．7倍，說明桑葉中含有此類靜葡糖苷酶抑製劑，並提出用含有高濃度的 DNJ或其它舟葡糖苷酶抑製劑的天然食品來防止糖尿病或肥胖症的發生，可能具有很大的潛在價 值。近來發現多羥基去甲莨菪烷生物鹼(polyhydroxy-nor-tropane B2(calysteginsBI，B2，四羥基)、打碗花素cl(calysteginC1，五羥基)就是這類物質。天然生物 lonescu．Tirgoviste桑葉及另兩種植物菜豆(Phaseolus vulgaris)的莢及歐洲越桔(Yaccinummyrtillus)的葉混合切碎， 再用其浸提液給患者服用，每天三次，每次150mL，每天的劑量為15 g，服用兩個月，結果發 K 表明，桑葉抽提物可使血糖降低53．8％，舒寧茶可使血糖降低60％．並且存在劑量效應。而Doi rabbits)飼以桑葉或 其1．丁醇提取物(MLBE)能降低其血臘濃度，減輕動脈粥樣化增厚。 Jang 表達被加強，而飼以桑葉水提物的STZ誘導糖尿病鼠NADPH-d酶活降低了。 導的糖尿病白鼠8周，結果控制了高血糖症、糖尿、蛋白尿，推遲了視網膜病的發作。而不添加 桑葉粉的對照組，8周後表現出了高血糖症、糖尿、蛋白尿等癥狀。通過測定對血糖、脂質過氧化 反應、谷胱甘肽濃度、6．磷酸葡萄糖脫氫酶及紅血球中各種抗氧酶的活性的影響，研究桑葉的抗 高血糖及抗氧化作用。結果，桑葉顯著降低糖尿病鼠的血糖濃度，糖尿病鼠紅血球中升高的脂質 33％。而糖尿病鼠被降低的谷胱甘 過氧化反應及過氧化氫酶活性也被顯著降低，分別降低48％}fl 肽濃度及6塒鎔酸葡萄糖脫氫酶活性以及谷胱甘肽過氧化酶、谷胱甘肽還原酶、過氧化物岐化酶 及抗氧化作用。 Kim Y，NPY)組織化學研究了桑葉對STZ誘導的糖尿病鼠齒狀腦回細胞增 及神經肽Y(neuropeptide 葉能夠促使正常及STZ誘導的糖尿病鼠齒狀腦回新細胞生成及NPY表達。在先前的研究中，對 於這個結果可能會認為桑葉對NPY表達的增加與桑葉對細胞增殖的影響有關。本研究表明，桑 葉可能有助於糖尿病中樞神經系統併發症的恢復。 d．結果其食物和水攝取量、 葉菲等(2002)給四氧嘧啶高血糖大鼠連續口服桑枝水提物15 空腹和非禁食血糖、血果糖氨及尿糖等高血糖綜合症指標均明顯降低，血脂得到調節，糖尿病腎 病得到改善。表明桑枝水提物可能對糖尿病及其併發症有一定的治療作用。

1．3．2抗氧化活性 通過氮藍四唑(NBT)光化還原法對桑葉、桑嫩芽、桑枝、桑皮、蠶沙中提取的黃酮類化台 物清除超氧離子自由基效果的測定表明，這些黃酮類物質對超氧離子自由基具有強烈的清除作 用，清除效果與黃酮含量有關．當嫩芽、桑枝、桑皮中黃酮類提取物的濃度為5「‖mL時，其清 acid) 強得多。5¨咖L的桑葉黃酮類提取物，其清除率也達到47．2％，比抗壞血酸也強得多(賈之慎 等，1996)。 Kim ．自由基有很強的清除作用。Doi 槲皮索還能夠抑製兔和人體內因銅誘導的氧化修飾而致的共軛雙烯及硫代巴比妥酸反應物質 (thiobarbimricacid reacting 白(10w．densny K等(2001)還發現桑葉中的兩種異戊二烯基黃 lipoprotein，LDL)的氧化。Doi 從雞桑皮中提取到的雞桑酮B(australone B，fMLP／CB)所致的大鼠嗜中性粒細胞 苯丙氨酸／細胞鬆弛紊B(formyl．Met-Leu-Phe／cytochalasin (neutrophils)生成超氧陰離子(superoxide 則能以濃度依賴方式抑製卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbolmyristate 中性粒細胞生成超氧明離子，其半抑製濃度IC50為66．9±2．5p．mol／L(Ko 這表明桑辛素在受脅迫的植物中有清除自由基的作用。uv壓力誘導產生的三種桑辛素成分 C、moracin moracin P，al，2001)。 桑辛素還能抑製脂質過氧化，這也有力地證明了其作為自由基清除劑的作用(Sharma KO等(2003)研究了桑皮中提取的桑苷A(mulberrosideA)及氧化白藜蘆醇 Chung H等(2002) 從桑乙醇提取物中分離到的5，7．dihydmxycoumarin．7-methyl 物清除活性，其Ic50分別為19．1土3．6p,mol／L、3．81土0．5 清除活性，其IC∞為23．4士1．5p。mol／L。 p,mol／L的濃度可使50％的酶活 製作用，並且其抑製作用呈劑量依賴性(抑製率為250／一84％)，1 etal，1998)。 目和位置在其對多巴氧化酶活性的抑製中起著重要的作用(Shin Lee 提取物抑製了黑色素生物合成過程中將多巴轉變成多巴色素的酪氨酸酶活性。通過對提取物的活 性追蹤，分離到的桑色苷F(Mulberroside 氨酸酶活性降低，對哺乳動物酪氨酸酶活性的Ic50值為68．3mg／mL。酪氨酸酶是黑色素生物合成 的關鍵酶，它將酪氨酸直接轉化成多巴醌．而bdopa只能由多巴的再生獲得。這～過程決定了動 物的膚色，並與局部色素沉著、黑索瘤、雀斑等的產生有關。經mulberrosideF處理後的melan．a acid)要弱。 的清除作用，但是這種活性較低，比曲酸(kojic Lee 抑製效應，結果發現一種植物提取物有酪氨酸酶抑製活性。在B．16黑素瘤細胞系中，桑枝提取 物顯示了對酪氨酸酶及黑色素合成的抑製。