蛋白桑：中藥桑葉品質評價及活性部位的純化工藝研究

摘要桑葉（ＦｏｌｉｕｍＭｏｉｌ）是我國的傳統中藥材之一，含有多種功能性成分，如礦物質、維生素、食物纖維、氨基酸、植物甾醇、黃酮類、生物鹼類、多糖等，具有降血糖、降血壓、降低膽固醇、抗衰老、提高免疫力、抗菌、抗病毒、防癌等多種生理功能，已日益成為醫藥和食品領域研究熱點。本文對湖州市不同採摘時間、不同種植基地、不同品種、不同部位的桑葉進行生物鹼以及多糖類成分分析，同時對主要活性部位分離純化工藝進行深入的研究，通過比較桑葉藥材的內在品質，分離桑葉有效部位，為湖州桑葉開發利用提供依據。此外，還考察了分離純化得到的桑葉總生物鹼浸膏對ａ一葡萄糖苷酶活力的影響以及其抑製作用類型，為桑葉降血糖作用研究提供參考。

１．桑葉中生物鹼及多糖類成分的含量測定目的：考察不同採摘時間、不同種植基地、不同品種及不同藥用部位桑葉中總生物鹼、１．脫氧野尻黴素以及多糖類成分的含量差異。方法：雷氏鹽比色法測定總生物鹼的含量；ＨＰＬＣ．ＥＬＳＤ方法測定１．脫氧野尻黴素含量，以ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＮＨ２（５Ｖｍ４．６ｘ２５０ｍｍ）柱為分離柱；流動相：乙腈一水（ｓｏ：２０）；流速１．０ｍＬｍｉｎｌ；柱溫：３０。Ｃ；ＥＬＳＤ氣化室溫度５５：高純氮作載氣，壓力１．５Ｂａｒ。苯酚一濃硫酸法測定總多糖的含量。結果：冬季桑葉樣品中總多糖的含量普遍高於其它季節樣品，而生物鹼類成分的含量隨季節變化無明顯規律；品種、種植基地以及採摘部位對桑葉中上述成分含量也有較大影響。浙江大學碩士學位論文中藥桑葉品質評價及活性部位的純化工藝研究結論：桑葉中生物鹼以及總多糖的含量與種植基地、採摘時間、品種以及采摘部位等相關。

２．桑葉活性部位樹脂純化工藝目的：研究分離、純化桑葉中主要活性部位黃酮、生物鹼和多糖的工藝條件及參數。方法：本文以殼聚糖作為絮凝劑對提取液進行澄清處理，並對絮凝條件進行優化。採用柱層析連續分離的方法，絮凝液依次經過大孑Ｌ樹脂和陽離子樹脂，同時分離得到桑葉中的黃酮類、多糖類和生物鹼類組份。本文以靜態飽和吸附量、靜態洗脫率、洗脫量為考察指標，比較了不同型號的陽離子樹脂分離、純化桑葉總生物鹼的工藝。又以各成分轉移率和各成分浸膏含量為指標，對最佳大孔樹脂以及陽離子樹脂吸附工藝條件進行了篩選。結果：殼聚糖對主要活性成分的轉移率高於傳統的醇沉工藝。Ｑ２型陽離子樹脂對生物鹼類成分具有較好的吸附及洗脫參數，其飽和吸附量達到３５．８１ｍｇ９１乾樹脂；經過工藝條件優選後，總黃酮轉移率和浸膏總黃酮含量平均值分別達到６５．１５％，７１．８６％；總生物鹼轉移率和浸膏總生物鹼含量平均值分別達到７４．５９％，５１．０９％；總多糖轉移率和浸膏總多糖含量平均值分別達到６９．９４％，６０．１１％。結論：Ｒ１型大孔樹脂以及Ｑ２型陽離子樹脂綜合性能較好，適用於桑葉中主要活性成分的分離純化。

３．桑葉生物鹼浸膏對俚一葡萄糖苷酶抑製作用的體外研究目的：初步研究從桑葉中提取分離得到生物鹼類成分對．葡萄糖苷酶活力的影響以及其抑製作用類型。方法：本文以拜糖平（ａｃａｒｂｏｓｅ）為陽性對照，採用洳葡萄糖苷酶體外抑製作用實驗，比較了桑葉生物鹼浸膏、市售的桑枝提取物以及拜糖平對ｎ．葡萄糖苷酶的抑製作用能力差異。結果：桑葉生物鹼提取物、桑枝提取物以及陽性葯拜糖平對弘葡萄糖苷酶的半抑製濃度ＩＣ５０分別為Ｏ．０７５ｍｇ／ｍｌ、０．１４２ｍｇ／ｍｌ、Ｏ．７０９ｒａｇ／ｍ１。其對ｏ．葡萄糖苷的抑製作用屬於競爭性可逆抑製。結論：桑葉生物鹼浸膏對舡葡萄糖苷酶活力有很強的抑製作用，其對ａ．葡萄糖苷酶的抑製作用優於市售的桑枝提取物和拜糖平。

中藥桑葉品質評價及活性部位的純化工藝研究桑為桑科落葉喬木桑ＭｏｒｕｓａｌｂａＬ．，全國各地大多有野生或栽培，以長江流域，尤以江浙一帶較多。《神農本草經》將桑列為中品，「方書稱桑之功最神，在人資用尤多」。其中桑葉、桑枝、桑白皮、桑椹均可入葯，『本草綱目》等古醫書對其功能多有記載。桑葉異名鐵扇子，首載於《神農本草經》，又稱其為「神仙葉」，其昧苦、又能止咳，有補益之功，具有滋陰補血，疏散風熱，益肝通氣，降壓利尿之功效，是中醫清熱解毒之要葯。《中藥大辭典》記載：清肝明目聰耳，鎮靜神經，潤肺熱，止咳，手足麻木，赤眼澀痛，解蛇蟲毒，可代茶止渴，通關節。《本草綱目》記載：桑葉乃手足陽明之葯，汁煎代茗，能止消渴，名目長髮。『乾妙方》：「治頭髮不長，桑葉，麻葉，煮潛水淋之，七次，可長數尺。」《壽世保元》中以桑葉為主的扶桑至寶丹「久服不以自登上壽」。歷代中醫文獻對其功能記載表明，我國古代就開始對桑葉的藥用價值進行研究。隨著現代科學技術的不斷發展，人們對桑葉的化學成分、藥理作用、保健功能等方面進行了深入的研究，發現桑葉中營養豐富，含有人體所需的１６種氨基酸、７種維生素、鋅、錳、鈣、鐵等多種礦物質以及生物鹼、黃酮、多糖、綠原酸、甾類等多種功能成分，具有降血糖、降血脂、降血壓、抗炎、抗衰老、抗腫瘤等多種藥理學活性，這些作用與防治人體慢性疾病，高血壓、糖尿病、動脈硬化、肥胖症等現代病及延年益壽密切相關。其中桑葉中所特有的，卜脫氧野尻霉素為代表的多種多羥基的生物鹼類成分以及桑葉多糖類成分具有很好的降血糖活性。桑葉以其極高的營養價值和藥用價值，被國家衛生部歸入「既是食品又是藥品」之列，並且被現行藥典收載，成為食品科技界和醫藥界關注的熱點。桑樹在我國大部分地區都有栽培，尤以江蘇、浙江一帶桑葉資源較為豐富，僅湖州就有３６萬畝桑園，因此，有必要對桑葉成分進行系統的品質分析研究，建立有效、可靠的品質分析方法，並掌握其成分含量變化的趨勢，篩選出藥用價值較高的品種，確定最佳採集時間，以有助於更科學地利用桑葉藥材資源。新江大學碩士學位論文中藥桑葉品質評價及活性部位的純化工藝研究桑葉中的黃酮、多糖以及生物鹼類成分是桑葉中最重要的三種活性成分。其中黃酮類化合物，以蘆丁、異槲皮苷含量較高，朝鮮學者Ｋｉｍ等從桑葉中分離得到九種類黃酮，桑葉中的黃酮成分具有降血壓、舒血管活性、清除自由基、抑製血清脂質增加和抑製動脈粥樣硬化形成的作用。Ａｓａｎｏ等通過改變Ｄ卜的提取和純化條件。從桑葉中分離出多種多羥基生物鹼。桑葉中生物鹼通過抑製耱苷酶的活性來減少小腸對糖的吸收，從而降低餐後血糖，同時它還能促進１３細胞分泌胰島索，緩解糖尿病患者胰島素絕對或相對減少的狀況，從而改善糖代謝，最終達到降血糖的效果。桑葉中的多糖可以提高糖尿病小鼠的耐糖能力，提高正常大鼠血中胰島素水準，另有研究顯示它能改善ＩＩ型糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用，提示桑葉多糖對治療ＩＩ型糖尿病有多項調節作用。本研究室己考察了不同種植基地、採摘季節、品種等因素對桑葉中的黃酮類成分的影響。本研究對具有降血糖活性的多糖和生物鹼類成分進行進一步的考察，進而綜合評價各因素對桑葉功效成分含量的影響，從而更好地完善對桑葉質量的評價，以便於迸一步的開發和利用。隨著中草藥化學成分提取分離技術的發展，人們開始日漸重視中藥有效部位和有效單體的開發，而關於其提取分離製備方法的研究，是進一步探討中藥的治病機制、控制中藥品質、提高製劑生產水準、提高臨床療效及進行資源開發的前提，是實現中藥現代化的關鍵。現有專利主要針對桑葉中生物鹼類成分分離純化以及其對ｄ一糖苷酶抑製作用的研究，但忽略了桑葉中黃酮及多糖成分。本研究旨在建立一簡便、經濟的方法同時分離得到桑葉中的多種活性成分。中藥絮凝劑殼聚糖近年來廣泛地應用於中藥提取液的澄清技術領域，其不但可以與藥液中負電荷的纖維素、丹寧、粘液質等雜質以及帶負電荷的細菌結合，形成沉澱而被除去，達到澄清藥液的目的，同時殼聚糖本身可生物降解，不會造成二次汙染。大孔吸附樹脂是近１０年來發展起來的一類有機高分子聚合物吸附劑，分離技術是採用樹脂從中藥及其復方中有選擇性地吸附其中的有效部分，去除無效部分的一種提取精製的新工藝。已較廣泛地應用於天然產物的分離。特別是用於黃酮類物質的提取分離。陽離子樹脂通過離子交換作用，與提取液中生物鹼陽離子祈江大學頸士學位論文中藥桑葉品質評價廈活性部位的純化工藝研究發生交換吸附，富集純化桑葉中含量較低的生物鹼類成分，同時將其與多糖類成分有效的分離開來。本研究採用柱層析連續分離的方法，絮凝液依次經過大孑Ｌ樹脂和陽離子樹脂，可以同時分離得到黃酮類、多糖類和生物鹼類組份。現已有研究分析比較了桑葉中三種成分的降血糖活性，其中生物鹼的活性最高，其次是多糖，黃酮的活性最低。而生物鹼中較為關注是以ＤＮＪ為代表一類多羥基的生物鹼成分，純化後得到的提取物中可能含有多種類型生物鹼類成分，通過體外研究進一步考察其對一糖苷酶抑製作用。同時已有研究發現，桑葉中的多糖是瑾－糖苷酶的競爭性抑製劑，而對生物鹼的抑製作用類型還未見報導。鑒於以上所述，本文對桑葉進行了以下三個方面的研究：Ｉ，桑葉中生物鹼及多糖類成分的含量測定２．桑葉中活性部位的樹脂純化工藝研究３．桑葉生物鹼浸膏對ｆｔ．．糖苷酶抑製作用的體外研究在本研究室對桑葉中黃酮類成分考察的基礎上，通過上述研究，考察了桑葉中的多糖及生物鹼類成分，為桑葉藥材的品質綜合評價提供依據，有助於桑葉的品質控制和活性部位研究，同時更深入地闡釋了生物鹼類成分的降血糖作用機浙江大學碩士學位論文中藥桑葉品質評價及活性部位的純化工藝研究第一章桑葉中生物鹼及多糖類成分的含量測定現代研究發現，桑葉中含有豐富的生物鹼類成分，是其降血糖藥理作用的活性成分，能夠抑製伽葡萄昔酶活性，維持胰島素的分泌，延緩糖尿病的發作和惡化。其中，１－脫氧野尻黴素ＮＪ）【１２１是桑葉中一種非常重要的生物鹼。桑葉中多糖『３州具有良好的改善糖耐量，抑製血脂升高，降低外周血清胰島素水準，改善ＩＩ型糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用，提示桑葉多糖治療ＩＩ型糖尿病具有多項調節作用。桑葉多糖可能對多種原因引起的糖尿病均有治療作用。本實驗建立了桑葉中的總生物鹼、ＤＮＪ以及總多糖含量測定方法，考察了不同採摘時間、不同種植基地、不同品種以及不同藥用部位桑葉中的總生物鹼、ＤＮＪ以及總多糖含量的變化，有助於建立合理、簡便、可靠的品質控制方法以及藥材的合理開發應用。