人蔘皂甙Rh2對人乳腺癌MCF7_AdrR細胞增殖和凋亡的影響

近年研究發現,人蔘具有抗癌活性,其主要活性成分人蔘皂苷能誘導細胞分化和凋亡,從而發揮抗腫瘤作用。人蔘皂苷單體Rh2(G -Rh2)是從紅參中分離得到的原人蔘二醇型單糖鏈皂苷單體化合, 是人蔘的主要抗癌成分。國內外報導[ 3- 9], Rh2對多種腫瘤細胞 (如小鼠黑色素瘤 B16細胞、C6膠質瘤細胞、人肝癌細胞 SK- HEP- 1等 )具有增殖抑製和誘導凋亡作用。為此本實驗以人乳腺癌 MCF7/AdrR細胞株為受試細胞, 研究 GS- Rh2的誘導凋亡作用, 旨在進一步闡明人蔘抗腫瘤作用機制,為其應用於腫瘤的臨床治療提供實驗依據。

材料與方法

1 材料

細胞培養 人耐葯乳腺癌細胞 MCF7/AdrR, 購自中國科學院上海細胞研究所; 細胞貼壁生長, 用含10% 胎牛血清的 RPM I1640培養基, 加阿黴素維持其耐藥性, 於 37 、5% CO2、95% 空氣飽和濕度培養箱培養, 適時傳代。藥品與試劑 人蔘單體 Rh2, 純度﹥ 98% , 上海融禾醫藥科技發展有限公司提供; 鹽酸阿黴素 ( adriam yc in, ADM ), 浙江海正葯業公司提供。四甲基偶氮唑鹽, 購自上海實生生物有限公司; 兔抗 Fas( 1 500)多克隆抗體、鼠抗 Bax( 1 500)單克隆抗體、鼠抗 Bcl- 2( 1 500 ) 單克隆抗體和兔抗 B cl- xL ( 1 500) 多克隆抗體, 均購自美國 Santa Cruz公司; 鼠抗 - actin單克隆抗體, 購自美國 S igm a公司; 二抗 ( 羊抗兔及羊抗鼠 ), 購自美國 Rockland公司; TRITC標記的羊抗鼠 IgG, 購自上海鼎國生物技術有限公司; Hoechst 33258細胞凋亡檢測試劑盒, 購自碧雲天生物技術研究所。

儀器 培養箱和超凈工作台, Thermo Forma公司產品; 垂直式電泳儀和濕轉裝置, 購自美國 Bio- Rad公司; 低溫高速離心機, 美國 Beckman coulter公司產品;酶標儀, 美國 Moular Device公司產品; 倒置顯微鏡, 日本 N ikon公司產品。

2 方法

2 1 分組將對數生長的 MCF7/AdrR細胞, 按下述均分成 6組:①對照組: 細胞加入等量的溶劑; ②ADM 組: 細胞加阿黴素 ③Rh2組: 細胞加 ④ ADM + 3 個劑量 Rh2組: 細胞加阿黴素和分別加不同濃度。

2.2 M TT法檢測 GS- Rh2對細胞生長的抑製作用取對數期細胞製成細胞懸液, MCF7/Adr以 4 &103個細胞 /孔接種於 96孔板, 每孔 100 L, 24 h後,藥物組加入不同濃度的 GS- Rh2, 使終濃度分別為10, 20, 40, 80, 160 ; 對照組與空白對照組加培養液 100 L。

分別在加藥後 24, 48, 72 h, 用MTT法檢測各孔中細胞的抑製率。用酶標儀檢測 490 nm 處吸光度值( A ) , 每組設 3個復孔, 實驗至少重複 3 次。

2.3 H oechst 33258染色檢測細胞凋亡

將細胞接種於置有蓋玻片的六孔板中, 待細胞生長至 70% ~ 80% 融合時, 用含0.5% 新生牛血清的 1640培液同步化 20 h, 加入相應的藥物繼續培養 24 h, 結束培養, 棄培液; 按照 Hoechst 33258細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行: 室溫固定 10m in, 用 PBS室溫洗滌 5m in3次; 加入 H oechst33258染色液, 室溫染色 5 m in後, 用抗熒光淬滅封片液封片; 熒光顯微鏡下觀察並拍照, H oechst 33258激發波長 345 nm, 發射波長 487 nm, 陽性信號呈藍色,凋亡細胞的細胞核呈緻密濃染或呈碎塊狀緻密濃染,

實驗至少重複 3次。

2.4 流式細胞儀

將細胞接種於 6 cm培養皿中,待細胞生長至 70% ~ 80%融合時, 用含 0 5%新生牛血清的 1640培液同步化 20 h, 加入相應的藥物繼續培養48 h, 結束培養, 收集培液, 可細胞刮杓, 輕柔刮下貼壁細胞, 用預冷的 PBS吹打, 轉移培液和細胞, 至預冷的15 mL 離心管中, 於 4 、2000 r#

m in- 1離心 5m in, 棄上清; 加入預冷的檸檬酸固定液 1 mL, 重懸細胞。送中國科學院上海細胞生物研究所, 作流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期, 實驗至少重複 3次。2 5 W estern b lot檢測當細胞生長融合至 30% ~ 40% 時, 將 MCF7/AdrR細胞的培養液, 加入相應的藥物作用 48 h後, 細胞裂解液提取細胞總蛋白, 定量後取等量樣本, 進行SDS- PAGE 電泳分離; 然後將蛋白轉移至 PVDF 膜上。將膜在封閉液中封閉 2 h, 分別與 Fas、Bax、Bcl-2和 Bc l- x l以及 - actin 的一抗於 4 孵育過夜。洗膜後, 再與二抗室溫孵育 1 h; TBST室溫洗膜 5 m in&3次; 將膜轉入新鮮配製的 ECL 化學發光孵育液中, 室溫孵育 5m in; 轉入 X光暗盒中, 曝光 3 m in, 顯影, 定影, 實驗均至少重複 3次。

3 統計學方法

用 SPSS10 0軟體完成統計學處理, 實驗數據以均數 ? 標準差表示, 組間分析比較採用 t 檢驗, P <0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 G S- Rh2對 MCF7/AdrR細胞增殖抑製作用用 MTT法檢測 GS- Rh2對 MCF7/AdrR細胞增殖抑製作用, 結果發現 GS- Rh2能明顯抑製 MCF7/AdrR細胞的增殖, 其抑製作用呈現出劑量 - 時間依賴性,與對照組比較有統計學差異 (P < 0 05),不同濃度人蔘皂甙 Rh2( GS - R h2) 在不同時間點對M CF7 /A drR 細胞的增殖抑製作用。

討 論

腫瘤的發生髮展是一種多基因、多步驟、多階段的複雜過程, 許多抗腫瘤藥物都可誘導或促進腫瘤細胞凋亡而發揮治療作用。本研究證實, 人蔘中的活性成分人蔘皂苷 - ( GS- Rh2) 能抑製人乳腺癌 MCF7 /A drR細胞增殖並誘導其凋亡。細胞凋亡是受基因調控的、主動的細胞死亡過程, 有其特徵性的形態和生化特徵。凋亡細胞的主要特徵是細胞增殖抑製, 流式細胞儀可檢測到出現凋亡細胞特徵峰 ( sub- G1峰 ), 細胞胞漿濃縮緻密, 核染色質凝集, 核裂解形成凋亡小體。本實驗從形態學、流式細胞儀檢測, 來確認細胞凋亡的發生。增殖抑製實驗結果表明, 3個濃度Rh2均能使 MCF7/AdrR細胞數量明顯下降, 其抑製作用呈明顯的劑量 - 時間依賴性。

Andrews等認為, 細胞凋亡是由正常的細胞周期改變引起的, 細胞凋亡與細胞周期阻滯有關, 細胞阻滯於哪一期, 凋亡就發生在哪一期。現代藥理學研究證實, 人蔘中含有多種具有抗腫瘤作用的皂苷, 它們能誘導細胞凋亡及引起細胞周期阻滯, 從而抑製腫瘤生長。本實驗用流式細胞儀檢測也表明: 3個濃度 Rh2+ ADM 組, 均能使 M CF7 /AdrR 細胞發生明顯的凋亡, 凋亡細胞 百分率分 別為 26 27%, 39 15%,47 08% 。

而且 Rh2+ ADM 組還能誘導 MCF 7 /AdrR細胞的 G0/G1期阻滯, 阻滯細胞由 G1期向 S期轉化,Rh2+ ADM 組隨 Rh2作用濃度的增加, 使 G0/G1期細胞含量上升及 S期細胞下降, 表明 GS- Rh2可通過抑製細胞 DNA的合成, 來誘導細胞發生凋亡, 推斷這可能是 GS- Rh2完成其抗腫瘤作用的機制之一。

通過H oechst 33258染色觀察了 Rh2對 MCF7/AdrR細胞凋亡的情況, 均發現有典型的凋亡細胞, 並可見到凋亡小體。Bc l- 2基因已證實為癌基因; Bax作用則相反。B cl- 2和 Bax形成了細胞凋亡的正負調控, 誘導細胞凋亡。本實驗結果顯示, 隨 Rh2+ ADM 組的Rh2濃度增加, Bcl- 2 /Bax比例下調, 而 Bcl- x l蛋白的表達, 在藥物作用前後無明顯的變化, 說明 GS- Rh2誘導 MCF7 /AdrR細胞的凋亡過程, 可能下調 Bcl- 2蛋白和上調 Bax蛋白的表達, 通過凋亡通路中線粒體的途徑實現的。 Fas是腫瘤壞死因子受體 ( TNFR) 和神經生長因子 ( NGF) 受體家族的細胞表面分子, Fas配體 ( FasL) 是 TNF 家族的細胞表面分子。 Fas/FasL 的主要作用是可以觸發細胞凋亡。

本實驗結果顯示, Fas蛋白表達, 隨藥物濃度的 增 加 而明 顯 增 強, 說明 GS - Rh2能上調MCF 7 /AdrR 細胞表面的 Fas蛋白表達, 通過凋亡通路中的死亡受體通路, 促進細胞亡。提示 GS- Rh2可以通過調節凋亡相關蛋白的表達, 參與調控人乳腺癌細胞的凋亡。腫瘤的發生、發展與細胞凋亡異常有密切的關係。許多抗腫瘤藥物都可誘導或促進腫瘤細胞凋亡而發揮治療作用。