2019年3月30日/醫麥客 eMedClub/--CAR-T療法的起源可以追溯到近30年前，20世紀90年代初，將基因導入細胞的技術剛剛開始發展。Michel Sadelain博士，現在是MSK(紀念斯隆-凱特林癌症中心)細胞工程中心主任，想利用這些新技術來改造T細胞，使它們具備更強的能力。
這在當時如同白日夢，十年後的2002年，Sadelain博士和他的MSK同事，包括Isabelle Rivière和Renier Brentjens，發表了一篇具有開創性的文章，表明用嵌合抗原受體(CAR)工程化的T細胞可以殺死腫瘤細胞並持續存在於體內。他們也是第一批證明，靶向血細胞表面的CD19標記物是殺死白血病和淋巴瘤的好方法。
來自MSKCC的CAR-T細胞療法先驅: (左起) Isabelle Rivière、Michel Sadelain和Renier Brentjens（圖片來源：MSKCC）
目前，自體(患者來源的)CAR-T細胞療法已顯示出對多種B細胞惡性腫瘤的顯著療效，最近的早期臨床試驗的結果表明其治療多發性骨髓瘤的潛力。然而，儘管反應率很高，部分患者會出現複發；其中一些是抗原陰性，另一些是抗原低表達。與導致完全和永久性抗原丟失的機制不同，那些導致抗原低表達的腫瘤逃逸機制仍未明確。
3月27日，權威期刊Nature上發表MSK研究人員Michel Sadelain和Isabelle Rivière等人的最新發現：白血病小鼠模型的研究顯示，CARs通過胞啃(trogocytosis, 一種免疫細胞具有的吞噬機制)引起腫瘤細胞的可逆性抗原丟失。這是一種活躍的過程，其中靶抗原被轉移到T細胞，通過促進T細胞殺傷和T細胞衰竭，降低腫瘤細胞上表達的靶抗原密度和降低T細胞活性。
該研究中，這些機制發現基於CD28和4-1BB的CAR，取決於抗原密度會有所差異。作者指出，這些動態特徵可以通過協同殺傷和組合靶向來抵消，以增強腫瘤對免疫療法的反應。
首先，研究人員將有限劑量的CD19 CAR-T細胞注入免疫缺陷的NALM6急性淋巴細胞白血病(ALL)小鼠模型中，模擬CAR治療複發：包含CD28或4-1BB共刺激結構域的CAR(分別稱為19-28ζ或19-BBζ)，在0.4×10^6-1.0×10^6 CAR-T細胞的劑量時有效控制NALM6細胞，但在0.2×10^6個細胞的劑量下，允許頻繁白血病複發。
儘管兩種類型的CAR-T細胞在輸注後兩周顯示有限的衰竭證據，但複發時19-BBζ細胞顯著耗盡，而19-28ζ細胞不再被檢測到，符合臨床經驗和CAR壓力測試模型。CD19表達在19-BBζ NALM6複發時減少，在19-28ζ複發和未處理的小鼠中保持不變。CD19的丟失發生在早期(第14天)，表明這在大量CAR-T細胞存在的情況下也會發生。包含單鏈Fv(scFv)抗體片段SJ25C116或FMC6313-15的CD19 CAR中發現了相同的模式。
CD19在腫瘤細胞中表達降低的同時，大部分CAR-T細胞CD19染色呈陽性。值得注意的是，在短期培養後，回收的NALM6細胞中CD19表達是可逆的。此外，CD19 mRNA的表達幾乎沒有變化，這些發現表明，在CAR-T細胞存在的情況下，CD19發生可逆的轉錄後丟失。
原來是胞啃作用！
當新鮮NALM6細胞從跨孔中的CAR-T細胞分離時，CD19表達沒有變化，但是當CAR-T細胞共培養時迅速減少，在與未轉導的T細胞或表達非信號CD19 CAR-T細胞的共培養物中沒有發現CD19丟失。
因此，CD19蛋白從NALM6細胞向T細胞的轉移顯示出CAR介導的胞啃作用的特徵，並且通過肌動蛋白聚合阻斷劑的抑製而進一步加重。
大量研究證據表明，表面蛋白在免疫細胞之間轉移的現象很普遍。通常，胞啃作用的過程是抗原依賴性的，其中一個最著名的例子是肽-主要組織相容性複合物(MHC)從抗原呈遞細胞(APC)轉移到T細胞。
與表達CD19-mCherry融合分子的CD19敲除NALM6細胞共培養時，檢測到CAR-T細胞中mCherry和CD19，表明全蛋白CD19膜提取。
表達CD19-mCherry的NALM6細胞裝載重鏈氨基酸，19-28ζ細胞裝載輕鏈氨基酸，然後分離mCherry陽性胞啃陽性(trog+)和陰性(trog-)單線態T細胞，這種短暫共培養物明確證實了trog+中存在CD19肽，並且沒有在trog-中發現。
CD81(可與CD19形成複合物)也在trog+而不是trog- T細胞中檢測到，同時在共培養的NALM6細胞中丟失。相反，CD22在NALM6細胞中保持不變，並且未在T細胞中檢測到。
與NALM6、SUP-B15、Raji和CD19+ SK-OV-3等細胞系共培養後發現類似的CD19胞啃，更為重要的是，同樣發生在與自體19-28ζ細胞與ALL或慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者的原始樣本共培養後。
所有其他測試的CAR靶標也觀察到CAR誘導的胞啃作用，包括CD22、B細胞成熟抗原(BCMA)和間皮素。
因此，胞啃作用導致的靶抗原獲取是CAR-T細胞的一般特徵，可能適用於許多(如果不是全部)抗原。
複發機制：胞啃 → 靶抗原下調+(自相殘殺)T細胞殺傷 (→ T細胞衰竭)
由於胞啃作用，CAR-T細胞吃掉腫瘤細胞上的靶抗原。隨著其越來越多的CD19穩定表達，19-28ζ和19-BBζ細胞均參與CD19+ T細胞殺傷，前者更多，與其更大的效應功能一致。這種自相殘殺通過trog+細胞中免疫檢查點分子PD-1、LAG-3和TIM-3的表達增加而得到減輕，並且19-28比19-BBζ細胞更多。在穩定共表達CAR和CD19的T細胞中，那些沒有死於自相殘殺的T細胞傾向於獲得耗盡標記物。
在最初的19-BBζ處理後10天，輸注「新鮮的」19-BBζ T細胞未能挽救複發傾向的小鼠，表明CD19密度已經降低到19-BBζ閾值功效以下的水準。然而，19-28ζ CAR-T細胞確實挽救了這些複發。
研究表明，兩種CAR之間存在抗原敏感性差異。攜帶NALM6 med或NALM6 low腫瘤的小鼠(分別在CD19基因的單等位基因或雙等位基因破壞後獲得)顯示對低劑量CAR治療的反應減弱，其中19-28ζ細胞始終誘導比19-BBζ細胞更長的存活。
這些研究證實，僅降低靶抗原密度就能導致CAR-T細胞抗性。加上T細胞衰竭和(自相殘殺)T細胞殺傷，從而導致抗原低表達的腫瘤複發。
策略一：合理的CAR-T細胞劑量
值得注意的是，當以較高劑量給葯時，19-BBζ細胞能夠控制野生型NALM6。由此，作者假設：靶細胞比率可以克服上述的克隆靈敏度閾值。如下所示：
CAR-T細胞協同性潛在增強克隆性腫瘤溶解不足（圖片來源：Nature）
在含有1個CAR-T細胞和1個NALM6細胞(1:1 E:T)的微孔中，19-28ζ細胞比19-BBζ細胞更可能溶解NALM6細胞(24小時內57％對39％)。形成T細胞-NALM6細胞結合物後，19-28ζ細胞在261±18分鐘後殺死NALM6細胞，而19-BBζ細胞在569±35分鐘內殺死NALM6細胞。19-BBζ細胞較低的殺傷能力並不是由於較差的抗原識別，因為非裂解性穩定偶聯物形成的頻率不低於但高於用19-28ζ細胞測量的頻率，並且在非裂解性偶聯物中的作用時間更長。
在含有2個CAR-T細胞和1個NALM6細胞(2:1 E:T)的微孔中，19-28ζ和19-BBζ細胞的腫瘤溶解頻率均增加至約75％。
對於19-28ζ細胞，這種增加可以通過加性殺傷來解釋，但是對於19-BBζ細胞，增益超過了簡單的加性效應。這種高於預期的腫瘤殺傷符合觀察到的：2個T細胞結合於同一腫瘤細胞的偶聯物的頻率，以及第二個T細胞偶聯物靶向細胞死亡的較短時間。
使用NALM6 med和NALM6 low靶細胞的微孔研究證實並擴展了這些結果，表明19-BBζ細胞對抗原損失比19-28ζ細胞更敏感，以及19-28ζ細胞之間隨著CD19密度降低的協同作用。
協同殺傷的可能性強調：靶細胞比率和基於群體的殺傷超越克隆限制的潛力。
策略二：組合靶向
上述研究提高了組合靶向治療可以減輕抗原低表達腫瘤的靶向的可能性，其已被提出用於預防抗原陰性腫瘤的免疫逃逸。
接下來，研究人員探索了組合可能性。
探索CAR-T療法的組合可能性（圖片來源：Nature）
◆ 0.2×10^6 19-BΒζ細胞處理NALM6小鼠，然後第二次輸注0.5×10^6 22-28ζ或22-BBζ細胞，結果無效，這與CD22表達降低和CAR-T細胞不良擴增相一致；
◆ 較高的CAR-T細胞劑量(1×10^6)提供了更好的存活益處，對於22-28ζ細胞更是如此；
◆ 雙重靶向(0.2×10^6 CD19/CD22 CAR-T細胞)比連續輸注更有效地防止抗原逃逸；
◆ 在較低的CD19抗原密度條件下，19-28ζ和22-BΒζ組合提供了最持久的反應，表現優於BΒζ CAR配對；在最低CD19水準，無論使用哪種CD22 CAR，共同靶向低密度CD22靶標都無法再挽救19-BΒζ CAR治療。
結論：組合靶向可以減少具有靶抗原低基線或胞啃後低表達的腫瘤逃逸，條件是CAR共刺激特徵適應於靶抗原密度。
單個或組合CAR-T細胞治療方案後預期結果的建模，包括抗原陽性複發與腫瘤控制（圖片來源：Nature）
最新研究表明，CAR-T細胞治療中未被T細胞殺死的腫瘤細胞易受胞啃作用導致抗原密度減少，其中幾種可能的後果取決於抗原密度，影響因素：靶細胞比率和CAR設計。
這些動態特徵也為設置更為合理的CAR-T細胞劑量和組合靶向策略提供了框架。
參考出處：
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