蛋白桑：桑葉、蠶體中1-脫氧野尻黴素的含量測定與此分析

摘要卜脫氧野尻黴素（ＤＮＪ）及其衍生物是一種高效的ａ．葡萄糖苷酶抑製劑，可用於治療糖尿病、肥胖症、病毒感染等疾病。已發現多種植物和微生物具有合成和積累ＤＮＪ的特性，其中以桑葉中的含量最高。蠶一生食桑，其體內的ＤＮＪ含量遠高於桑葉。受測試方法的限制，目前對於桑葉和蠶體中ＤＮＪ含量的變化或富集規律的系統研究並不多。本文建立了反相高效液相色譜一紫外檢測法（ＲＰ—ＨＰＬＣ—ＵＶ）測定ＤＮＪ的方法，利用該方法系統研究了桑葉中ＤＮＪ含量的變化規律，以及蠶體對ＤＮＪ的富集作用。植物生物鹼是植物在與昆蟲協同進化過程中形成的一大類具有防禦功能的次生代謝物質，ＤＮＪ是桑葉中含量較高的一種生物鹼，但ＤＮＪ的對家蠶以外的昆蟲的影響作用研究也較少。本論文在這些方面進行了一些研究，主要結果如下：１．ＤＮＪ測定方法。以Ｏ．０５ｍｏｌ幾的ＨＣｌ為溶劑提取蠶粉和桑葉粉中ＤＮＪ，９一芴甲基氯甲酸甲酯（ＦＭＯＣ—Ｃ１）為衍生化劑，０．４ｍｏｌ／Ｌ硼酸鉀緩衝液ｐＨ＝８．５中進行衍生化反應，生成具有紫外吸收的ＤＮＪ—ＦＭＯＣ絡合物，反相高效液相色譜一紫外檢測法測定ＤＮＪ—ＦＭＯＣ。結果表明：衍生產物的色譜分離效果好，ＤＮＪ—ＦＭＯＣ峰面積與ＤＮＪ濃度呈正相關，加樣回收率為９４．９８％，精密度實驗、重現性實驗、穩定性實驗、回收率實驗表明該方法可靠，可以作為家蠶、桑葉和相關藥品保健品中ＤＮＪ含量測定的有效方法。２．採用反相高效液相色譜（ＲＰ—ＨＰＬＣ—ＵＶ）法測定了野蠶、家蠶不同品系間、５齡幼蟲不同組織器官以及家蠶幼蟲５齡不同生長時期的卜脫氧野尻黴素（ＤＮＪ）含量。結果表明：野蠶與家蠶、家蠶不同品系間ＤＮＪ含量存在極顯著差異。在測試的樣本中，野蠶全蠶粉中ＤＮＪ含量最高，為０．４２７８％，油蠶次之，黃血蠶最低，為０．２２０５％；家蠶不同組織中ＤＮＪ含量存在明顯差異，蠶血粉含量最高，其次是中腸、體壁和脂肪體。絲腺幾乎檢測不出ＤＮＪ；蠶體內ＤＮＪ含量隨蠶的發育呈明顯變化，從利川降血糖成分ＤＮＪ的角度看，以油蠶製作全蠶粉，５齡３天一４滅的幼蟲是比較好的。３．測定栽培桑魯桑、白桑、山桑、３大類９個品種，野牛桑蒙桑、鬼桑、華桑、長果桑４大類６個品種的ＤＮＪ含量，結果顯示：ＤＮＪ含量蒙桑＞鬼桑＞長果桑＞魯桑＞山桑＞白桑＞華桑，蒙桑含量最高，華桑最低；蒙桑、鬼桑、長果桑３種野生桑中ＤＮＪ含量極顯著高於其他種；栽培種中自桑和Ｆ日白桑ＤＮＪ含量最高為０．１１％，垂枝桑含量最低，為０．０２１％；魯桑三個品種的含量在栽培種中均較高，為０．０７５—０．１０５％；不同地方栽培品種ＤＮＪ含量差異大。桑葉漿液汁中的ＤＮＪ含量極其顯著高於桑葉全葉、葉片、葉脈，ＤＮＪ主要存在於桑葉漿液汁中。研究顯示，野生桑是很好的利用活性物質的材料來源。４．採用鹽酸酸抽提，陽離子交換提純法從全蠶粉和桑葉粉中獲得分別獲得ＤＮＪ產品的得率為１．４７８９％和０．４８９９％，純度為６２．９２６９％和８５．７８７７％。結果表明，鹽酸抽提，陽離子交換提純法提取桑、蠶中ＤＮＪ是一個比較可行的方法。產品的ＤＮＪ純度都高於６０％，是目前比較理想的方法。５．以來自煙草夜蛾卵巢的培養細胞ｓｆ９、ｓｆ２１和家蠶卵巢培養細胞ＢＩｆｌＮ為實驗對象，分別以不同濃度ＤＮＪ對三種培養昆蟲細胞添加處理，培養一定時間後，ＭＴＴ法測定細胞增殖抑製率。處理３６小時時對三種細胞增殖僅表現為輕微抑製或促進作用，但沒有呈現一定規律，表明此時ＤＮＪ沒有對細胞增殖形成明顯影響。處理７２小時，ＤＮＪ對家蠶ＢＩＩｌＮ細胞表現為促進作用，有劑量效應，低濃度時高促進增殖，高濃度促進作用降低；對ｓＦ２１增殖表現為抑製作用，抑製率呈現劑量效應，高濃度抑製率高，低濃度抑製率低，表現出ＤＮＪ對ｓｆ２１的毒性作用；ＤＮＪ對Ｓｆ９細胞增殖有促進作用，不同濃度均有較高的增殖促進作用，但沒有規律性。

神經細胞的損傷和破壞，同時提高體內超氧化物歧化酶的活性，阻止超氧化物的形成，從而對神經系統機能的衰老起延緩作用。朱祥瑞等瓣研究發現桑葉可提贏清除自由基酶的活性，降低組織中的脂褐素，具有清除自由基、延緩衰老的作用。太川幸予１４２】研究發現桑葉具有抑癌作用，可能是維生素、ＳＯＤ和黃酮類化合物的綜合作用結果。此外，桑葉還具有抗炎、抗動脈嬡化和抗絲蟲等功效。綜上所述，桑葉對生物體具有多種藥理作用，可以維持和增進生物體的健康。所以桑葉被開發成多種保健品上市，受人親睞，如桑葉茶、桑葉汁飲料，功能保健性食髭、超細粉未的食晶添加荊、桑時保健酒及桑葉優酪乳等。１．２家蠶幼蟲的化學成分及藥理作用的研究進展家蠶幼蟲是以桑時為主要天然飼料，它們從桑葉中攝取維持身體機能和成長所必需的各種營養物質，主要包括蛋白質、糖類、脂質、維生素、無機鹽和水分等。蠶體干物主要是糨蛋自。吃較蠶體和桑葉的主要成分，發現蠶體中粗蛋盤、粗脂肪、灰分、Ｚｎ明顯高於桑葉，而拳Ｒ纖維、纖維素、半纖維素、術質素、中性洗滌纖維（ＮＤＦ）、酸性洗滌纖維（ＡＤＦ）等明顯低於桑葉。糖類在桑葉中的主要存在形式是果糖和纖維素，其含量約佔桑葉干物質的３５％．４０％，褥在家蠶體中雯主要以海藻糖的形式存在，其含量約佔皿糖總量的９０％以上。蠶粉中含有１９種遊離氨基酸（約佔２ｌ。５％），生物活性多肽含量豐富（＞６毽眈），還含有Ｓ∞、凝集素、保幼激素多種維生素和海藻糖等，這些成分是機體構成和維持幣常生理功能所必需的。生物活性多肽是與生長、發育、免疫、造血等重要生命活動都密切相關的重要物質，海藻糖具有保護生物細胞和生物活性物質在脫水、高溫、冷凍、高滲透壓及有毒物質等不良環境條件下活性免遭破壞的功能。凝集素具有抗病毒作用，ＳＯＤ其有抗衰老作用。另外，蠶粉中還含有特殊功能的活性物溪生物鹼．１一脫氧野尻黴素（ＤＮＪ），佔乾品的Ｏ．４％。家蠶幼蟲體的藥用價值很早就被人們所認識。在《齊民要術》、《天工開物》、《神農本革》、《本草綱目》等古代醫書中都有家蠶幼蟲體入葯的記載。其功效勢主治小夕毛疳熱、消瘦、消漏（郤糖尿病）等疾病。現代醫藥學進一步證明了家蠶幼蟲體的藥用價值，並在其藥理學基礎方面進行了深入研究。研究發現家蠶幼蟲體在調節入體新陳代謝、降低血脂、護肝等方面均有顯著的作用。在循環系統方面，自１９９２年起，韓國蠶絲昆蟲研究所，對蠶的生理功能及實用效果進行了深入研究，證明了５齡第３天家蠶幼蟲經冷凍乾燥製成的全蠶粉末輿有治療糖尿病的功效。因為蠶粉對於人體內的葡萄糖營酶的活性作用具有較強的抑製作用，有效阻礙二糖水解為人體易於吸收的單糖，從而降低血糖值，適合糖尿病患者長期服朋此外，蠶粉還能降低血脂與膽固醇，對心斑管疾病具有一定的治療作用。家蠶幼蟲體具有良好降衄糖作用的藥理學基礎是寓含多種降血糖的活性物質，已查明主要還有黃酮類純合物、蛋自質多肽ＰＴ豫、甾族激素姍。蠶粉－ｆ，含訂高比例的小飽和脂肪酸，其中包括人體必需脂肪酸：（１一業麻酸、亞油酸，還含有較高的維乍豢Ａ。啞麻酸具有明顯的降血壓、降血脂、降Ｈ｝ｌｌ＾ｌ醇的作用，同時也具仃較；〔Ｊ，的抗炎作用ｌｌ引。而家蠶幼蟲體內富含的高比例不飽和脂肪酸是其調：爺血脂的｝要活性物質之一。在抗癌、抑製腫瘤和提高免疫力方而，蠶粉中主要含蛋Ｆ１質、多種氨基酸、脂肪酸和多糖，還有少量抗菌肽、干擾素和微量元素硒等，其中氨基酸、多糖、抗菌肽和硒等經證實具有抗癌作用。蠶粉中含的干擾素是已知的『種具抗痛作用的化學物質，因此具備較強的抑製腫瘤作用，尤其是對肺癌效果明顯。蠶寶素是在家蠶中提取得到的一種可透析物，其中主要含蛋白質、１8種氨基酸和ｌｏ余種微量元素。進行的抗腫瘤實驗，證明其對腫瘤抑製率很高。而如此豐富的營養組成，同樣適用於蛋白代謝障礙、白蛋白低下的患者，在提高機體免疫力、強身健體等方面有其獨特的優勢，同時間接地起到護肝作用。方予龍等報導，蠶粉還有抗疲勞的功效。１．３利用蠶桑產品產物治療糖尿病利用桑、蠶及其相關產物治療消渴病，在傳統中醫著作和國內外民間驗方、秘方中早有記載。《本草綱目》中記載，桑葉「汁煎代茗，能止渴消渴」，「灸熟煎飲，代茶止渴」。桑葉水提物、蠶沙、蠶繭湯等都是常用的治療糖尿病的蠶桑產品。１９６３年Ｓｈａｎ等最早報導了桑葉水提取液具有降血糖作用。１９７６年Ｙｏｓｈｉａｋｉ等首次從桑樹中分離到１一脫氧野尻黴素（１．ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ，ＤＮＪ）。２０世紀９０年代，Ａｓａｎｏ等從桑葉中分離出６種生物鹼，Ｋａｔｏ確定了其結構。礎ｍｕｒａ等研究了以上６種化合物的降血糖效果，確認ＧＡＬ．ＤＮＪ和ｆａｇｏｍｉｎｅ降血糖作用最強。已有的研究表明，桑葉的水提取物、醇提取物降血糖和治療糖尿病的有效成分包括ＤＮＪ、桑葉多糖、黃酮類物質等【圯Ｊ。桑白皮又名桑根皮、桑皮。性寒味甘，歸肺經。《別錄》載：「去肺中水氣，唾血，熱渴，水腫，腹滿腫脹，利水道，可以縫金瘡」。２０世紀７０年代從桑白皮中分離出ｍｏｒａｌｌｏｌｉｎｅ並證實它有降血糖的作用。蠶沙是一種臨床常用的中藥材，中醫認為具有祛風出濕、活血定痛的作用。蠶繭或繅絲湯具有滋陰潤燥、生精止渴作用，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消等疾病。應用家蠶全蠶粉治療糖尿病，最早始於韓國學者的研究，自１９９２年，就蠶粉對人體的生理效應進行了系統研究，發現５齡第３天凍乾蠶粉的降糖活性最高，蠶品種、飼養季節和飼料等能影響降血糖活性。利用全蠶粉製作的降血糖製劑已在韓國、泰國等國家上市，獲得了良好的評價，目前韓國飼養的蠶８０％以上用於生產治療糖尿病的藥物。國內學者也研究確認了蠶粉或蠶蛹粉的降血糖效果，同時具有降血脂、抗疲勞等作用。崔為正等以全蠶粉為主要成分研製的複合藥物，其降血糖效果明顯優於單純全蠶粉。已有的研究成果表明，全蠶粉的主要作用是通過其有效成分ＤＮＪ抑製小腸中二糖的分解從而抑製了小腸對二糖的吸收，降低餐後的血糖值，從而起到降糖效果。