探討天麻對睡眠的促進作用及其對中樞DA系統的影響

摘要：目的探討天麻對小鼠睡眠的促進作用及其對中樞多巴胺（DA）系統的影響，並進一步研究天麻有效成分天麻素通過影響DA通路發揮作用的機制。方法小鼠隨機分為對照組、天麻組、橄欖油組、天麻-橄欖油組及陽性對照艾司唑侖組，每組10隻，分別ig給予生理鹽水、天麻、橄欖油、天麻-橄欖油和艾司唑侖，連續給葯20 d。各組小鼠分別在第7、20天給葯30～40 min後ip最大閾下劑量戊巴比妥鈉（35 mg/kg），測定睡眠發生率；分別在第8天及第21天ip最小閾上劑量戊巴比妥鈉（50 mg/kg），檢測小鼠睡眠潛伏期和睡眠時長；採用ELISA法測定天麻對小鼠腦組織DA水準的影響；採用qRT-PCR法檢測天麻對DA受體各亞型表達的影響；構建DA受體D1、D2誘導表達穩定細胞株，Westernblotting法檢測ERK通路相關蛋白的表達水準。結果與對照組比較，天麻給葯20 d後小鼠睡眠潛伏期顯著縮短，睡眠發生率提高，睡眠時長延長，中樞DA水準顯著提高，DA受體各亞型的表達水準顯著上調。同時，天麻中有效成分天麻素可激活DA受體D2而不是D1介導的信號通路。結論天麻可能通過上調中樞DA系統活性進而調控睡眠，天麻中有效成分天麻素可能通過D2介導的信號通路發揮作用。

失眠已經成為影響現代人健康的重要問題之一，據調查，我國約47.2%的老年人存在不同形式的睡眠障礙，並且這一問題呈現出逐年年輕化的趨勢[1]。失眠不僅會誘導情緒的過度興奮（焦慮、反叛和心境惡劣的人格特質），而且與精神疾病高度共存，是產生抑鬱和自殺傾向的重要誘導因素[2-3]。目前臨床治療失眠的藥物主要包括苯二氮?類藥物（三唑侖、艾司唑侖、硝基安定等）、褪黑素受體激動劑和具有催眠效果的抗抑鬱藥物[4]。

苯二氮?類藥物主要與苯二氮受體結合發揮作用，可增強γ-氨基丁酸（GABA）能神經的功能，促進Cl離子內流，使神經細胞膜超極化。由於苯二氮?類藥物彌散性地抑製中樞神經系統，常帶來戒斷綜合症和白天殘留效應等副作用[4]，而褪黑素受體激動劑如褪黑素容易產生耐藥性和藥物依賴[5]。近年來，神經解剖學、藥理學和分子生物學研究發現多巴胺（DA）能神經元與睡眠覺醒腦區間有著廣泛的纖維聯繫，臨床常用的以DA受體為靶點的抗精神病藥物都具有良好的鎮靜安神作用，如DA受體D1拮抗劑氯氮平以及FDA批準的2個DA受體D2拮抗劑氟奮乃靜和三氟拉嗪[6]。研究發現D2是維持睡眠和覺醒的重要受體[7]。安神類中藥有效成分可以通過調節包括DA在內的神經遞質及其受體系統而發揮鎮靜催眠作用[8]。天麻是蘭科植物天麻Gastrodia elataBl.的乾燥塊莖，是我國名貴中藥，具有鎮靜安神、息風止痙、平抑肝陽等多種功效，廣泛用於小兒驚風、癲癇抽搐、破傷風、頭痛眩暈等病症的治療[9]。天麻的主要化學成分有天麻素（0.19%～0.82%）、天麻苷元（0.01%～0.12%）、香草醇、天麻多糖、氨基酸和微量元素等[10-11]，其中水溶性的天麻素和脂水兩親性的天麻苷元因較強的藥物活性受到越來越多的關注。現代藥理研究表明，天麻對中樞神經系統具有明顯的調控功能，可發揮鎮靜安神作用[12]。張苗旋等[13]發現天麻1.2 g/kg可明顯延長戊巴比妥鈉誘導小鼠的睡眠時間，但具體機制並不清楚。

本研究利用經典的小鼠睡眠實驗探討天麻對睡眠的促進作用及其對中樞DA系統的影響，並進一步研究天麻有效成分天麻素通過影響DA通路發揮作用的機制，為研究天麻對中樞神經系統的影響提供實驗依據。

1材料

1.1動物與細胞

SPF級昆明種小鼠50隻，雌雄各半，體質量（20±2）g，購自昆明醫科大學SPF級實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（滇）K2015-0002，飼養於昆明理工大學動物實驗中心，飼養室溫度為（25.0±0.5）℃，採用全價營養顆粒鼠飼料，動物自由取食、飲水。源自人胚胎腎細胞的Flp-inTM T-RexTM HEK293細胞購自Invitrogen公司。

1.2藥品與試劑

天麻於2018年4月25日購自雲南省昭通市藥材市場，為2017年12月採收，經昆明理工大學生科院郝倩博士鑒定為昭通烏天麻Gastrodia elata Bl.f.glauca S.Chow.的乾燥塊莖；戊巴比妥鈉（山東西亞化學股份有限公司，批號F074）；艾司唑侖片（常州四葯製藥有限公司，批號20170812）；特級初榨橄欖油（Olitalia公司）；生理鹽水（昆明南疆製藥有限公司）；第一鏈cDNA合成試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，）；qRT-PCR DNA熒光染料（Roche公司）；小鼠多巴胺ELISA試劑盒（Mlbio公司）；胎牛血清、DMEM培養基（Gibco公司）；雙抗、胰蛋白酶（Hyclone公司）；細胞外信號調節激酶（ERK1/2）、p-ERK1/2抗體（CellSignaling Technology公司）；VSV抗體（Sigma公司）；山羊抗兔二抗（Invitrogen公司）；山羊抗鼠二抗（Sera Care公司）；天麻素（批號BP0627，質量分數＞95%，成都普瑞法科技開發有限公司）；多巴胺鹽酸鹽（批號BCBQ4375V，質量分數98%，Sigma公司）。

1.3儀器

高速離心機（Labogene公司）；微量移液槍（Gilson公司）；通用手術器械（上海醫療器械有限公司）；BX-50奧林巴斯顯微鏡（Olympus公司）；電子天平（Ohaus公司）；酶標儀（Bmglabtec公司）；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（Roche公司）；DYY-7C型電泳儀（北京六一儀器有限公司）。

2方法

2.1藥品配製

稱取天麻粉（全天麻烘乾超微粉碎製得）0.24 g混勻於4 mL生理鹽水中製成0.6 g/mL混懸液待用。稱取天麻粉0.24 g，加入1 mL橄欖油和3 mL生理鹽水，製成含25%橄欖油的天麻粉混懸液，備用。稱取0.4 mg艾司唑侖粉末，加入4 mL生理鹽水製成0.1 mg/mL的混懸液備用。取1 mL橄欖油與3 mL生理鹽水，使用時混勻吸取。

2.2分組與給葯

將50隻小鼠隨機分為5組，分別為對照組、天麻組、橄欖油組、天麻-橄欖油組及陽性對照艾司唑侖組，每組10隻，雌雄各半。對照組小鼠每隻ig給予生理鹽水0.4 mL，天麻組小鼠ig給予溶於生理鹽水的天麻粉1.2 g/kg[13]，橄欖油組小鼠每隻ig給予25%橄欖油生理鹽水混懸液0.4 mL，天麻-橄欖油組小鼠每隻ig給予含25%橄欖油的天麻粉混懸液1.2 g/kg，艾司唑侖組小鼠ig給予2 mg/kg的艾司唑侖，連續給葯20 d。各組小鼠分別在第7、20天給葯30～40 min後ip最大閾下劑量戊巴比妥鈉（35 mg/kg），測定睡眠發生率（以翻正反射消失為進入睡眠）；分別在第8天給葯30～40 min後及第21天ip最小閾上劑量戊巴比妥鈉（50mg/kg），檢測小鼠睡眠潛伏期（從注射戊巴比妥鈉到小鼠翻正反射消失的時間段）和睡眠時長（翻正反射消失到翻正反射恢復的時間段）。

2.3 qRT-PCR檢測多巴胺受體各亞型mRNA表達

利用相關軟體設計qRT-PCR引物並利用NCBI的Primer Blast功能驗證引物特異性，引物序列見表1。連續給葯20 d，測定小鼠各項睡眠指標後頸椎脫臼法處死小鼠並取全腦勻漿，稱取全腦勻漿約0.1 g，用1 mL Trizol裂解，提取總RNA並及時反轉錄成cDNA用於qRT-PCR。以cDNA為模板配製成20μL的反應體系，使用RocheLight Cycler96實時熒光定量PCR儀進行測定，具體反應條件為：95℃、10 min預變性，95℃、10 s，60℃、10 s，72℃、15 s，共40個循環。採用2?ΔΔCt法計算實驗組各基因的相對表達水準。

2.4 ELISA法檢測小鼠腦組織DA水準

頸椎脫臼法處死小鼠並稱取約0.1 g的小鼠全腦於0.8 mL 1×PBS中快速混勻，並充分渦旋使遞質溶出，5 000×g離心10 min，取上清按照試劑盒說明書採用ELISA法檢測DA水準。

2.5 Western blotting法檢測DA受體D1、D2誘導表達穩定細胞株ERK通路相關蛋白的表達

利用Flp-in T-Rex HEK293?系統，將含有D1和D2編碼序列的誘導表達載體pCDNA5/FRT/TO-VSV-GluR5-D1/D2與可以在哺乳動物細胞中過表達整合酶的pOG44載體共轉染Flp-in T-Rex HEK293細胞，並用潮黴素篩選，得到由多西環素（DOX）誘導表達多巴胺受體D1和D2的穩定細胞株。

用DOX以終質量濃度10 ng/mL誘導上述穩定株24 h，血清飢餓12 h，分別使用0.001、0.100、10.000 nmol/L的天麻素分別處理D1和D2細胞（分別都以空載體細胞為陰性對照）各5 min，以DA受體激動劑多巴胺鹽酸鹽（100 nmol/L）作為陽性對照。在上述處理過的細胞中加入含有蛋白酶抑製劑和磷酸酶抑製劑的RIPA裂解液，充分裂解細胞，蛋白定量，與SDS上樣緩衝液混勻，利用SDS-PAGE凝膠電泳進行分離並轉移到PVDF膜上，以5%脫脂牛奶封閉。用一抗（VSV、ERK1/2和pERK1/2抗體）分別孵育2 h。TBST/T洗膜3次，相應二抗孵育1 h。TBST/T洗膜3次。最後配製化學發光底物，並在化學發光儀上對靶蛋收據帶進行曝光顯影。

2.6統計學方法

應用統計學軟體SPSS Statistics 22.0進行數據分析，組內比較採用t檢驗，組間比較採用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

3結果

3.1天麻對小鼠睡眠的影響

為了觀察天麻水溶性和脂溶性成分可能的不同效果，將天麻粉分別與生理鹽水或生理鹽水加橄欖油混合，利用藥物輔助戊巴比妥鈉促進睡眠實驗檢測天麻鎮靜安神的功效。與對照組比較，連續給葯7 d後天麻組小鼠睡眠發生率提高（表2），但睡眠潛伏期和睡眠時長未發生明顯變化（圖1）；連續給葯20d後，天麻組小鼠睡眠發生率較給葯7 d無明顯增加（表2），但睡眠潛伏期縮短，睡眠時長增加；天麻-橄欖油組小鼠的睡眠潛伏期顯著縮短（P＜0.001，圖1）。提示天麻中的有效成分發揮穩定的促進睡眠的效果可能需要一定時間，是一個緩慢的過程。

3.2天麻對小鼠腦內神經遞質DA水準的影響

結果顯示，與對照組比較，天麻組和天麻-橄欖油組小鼠腦內DA水準均顯著提高，天麻-橄欖油組DA水準上調幅度更為明顯（P＜0.01、0.001，圖2）。天麻-橄欖油組相對於橄欖油組小鼠腦內DA含量提高約36%，高於天麻組相對於對照組的提高幅度（約25%）。陽性對照艾司唑侖組小鼠腦內DA水準顯著高於對照組（P＜0.001，圖2）。

3.3天麻對DA受體各亞型表達的影響

採用qRT-PCR法檢測小鼠腦內D1～D5的表達。結果顯示，與對照組比較，天麻顯著提高了小鼠大腦中樞各個亞型DA受體的表達（圖3），且其效果優於艾司唑侖。同時，各組小鼠各個亞型DA受體的上調趨勢一致。提示天麻在促進小鼠睡眠過程中，D1樣受體和D2樣受體可能均參與了調控，而天麻水溶性成分（如天麻素）可能扮演了更重要的角色。

3.4天麻素對ERK通路相關蛋白表達的影響

為觀察天麻素對DA受體介導的通路的作用，採用Westwenblotting法檢測ERK通路的效應蛋白ERK1/2及p-ERK1/2表達水準。結果（圖4）顯示，與對照組比較，天麻素可以通過DA受體D2激活ERK1/2，顯著提高p-ERK1/2水準，效果與多巴胺鹽酸鹽相當，但劑量依賴不明顯。而天麻素對D1受體介導的ERK1/2通路激活作用並不明顯。提示天麻素可能主要通過D2受體激活ERK1/2通路發揮睡眠調控作用。

4討論

中樞的DA系統是調控睡眠和覺醒的重要組分[14]。D1和D2都可以被DA激活，從而激活下遊信號通路，其中ERK1/2是D1和D2通路的重要分子標記[15-16]。激動劑可通過D1或D2激活效應蛋白ERK1/2，提高ERK1/2磷酸化水準[15-16]。ERK1/2屬於絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能在生理和病理條件下參與中樞神經系統的功能調節。本研究發現，天麻能夠提高小鼠中樞神經遞質DA水準，並上調各個亞型DA受體的表達，發揮促進睡眠的作用，這些作用可能部分由天麻中水溶性成分天麻素通過D2激活ERK1/2通路來實現。

天麻作為我國的名貴中藥，近代藥理學研究表明其具有良好的鎮靜催眠作用[17]。本實驗中，與對照組比較，天麻可明顯提高小鼠的睡眠發生率，顯著縮短睡眠潛伏期並增加了睡眠時長。其中，天麻-橄欖油組小鼠的睡眠潛伏期顯著縮短，天麻組小鼠睡眠時長顯著增加，提示天麻中脂溶性成分可能具有加速入眠的功能，而水溶性成分可能具有延長睡眠時間的作用。

失眠作為一種原發性或繼發性睡眠障礙，其發病機制與神經遞質紊亂、睡眠相關受體表達失常、生活壓力過大等一系列因素相關。DA作為哺乳動物腦內含量最多的神經遞質之一，參與了機體睡眠-覺醒、運動、認知行為和正性強化等多項功能的調控。郝晉東等[18]發現天麻素可提高大鼠紋狀體多巴胺含量，龐宇涵等[19]發現人蔘益智膠囊可提高小鼠腦內去甲腎上腺素（NE）、DA、5-羥色胺（5-HT）含量，改善小鼠的睡眠。本研究結果表明，天麻可顯著提高小鼠腦部DA水準，同時發現DA受體各亞型的表達量也有顯著提高，因為中腦邊緣DA系統具有調控興奮和鎮靜的雙重作用[20]，且哺乳動物的睡眠還受到γ-氨基丁酸A型受體（GABAa）、Melatonin、5-HT、Orexin等多種受體的調控。本研究初步證明天麻可提高中樞DA系統的活力，但其不同於褪黑素系統發揮的快速促睡眠功效[21]，天麻中的有效成分能夠以一個較為緩慢的過程發揮促睡眠作用。更為確切的調控機制還需深入研究。實驗中發現橄欖油也可提高小鼠腦內DA水準和DA受體表達量，推測這可能是橄欖油在抗衰老與益智健腦方面作用的機制之一[22]。