蛋白桑：桑葉多糖MLP_對糖尿病模型大鼠糖代謝的改善作用

摘要採用小劑量注射鏈脲佐菌素聯合高脂高糖飲食建立糖尿病大鼠模型，並灌胃給予桑葉多 糖 MLPⅡ ， 用 電子顯微鏡觀察各試驗組大鼠肝臟組織超微結構變化，採用 Western blot 與 RT-PCR 方法分別檢測大鼠肝臟組織的葡萄糖激酶（ glucokinase，GCK） 和胰島素受體底物 2（ insulin receptor substrate 2， IRS- 2） 的 蛋白 質表達水準以及基因 mRNA 轉錄水準， 研究桑葉多 糖MLPⅡ 的降血糖作用機制。 結果表明： 與糖尿病模型對照組相比，150 mg/kg 桑葉多 糖 MLPⅡ 治療 組大鼠肝臟細胞超微結構得到明顯改善，肝甘糖顆粒明顯增多 ，GCK 和 IRS- 2 的蛋白質表達水準及基因 mRNA 轉錄水準顯著上升（ P ＜ 0. 05） 。 結果提示，桑葉多 糖 MLPⅡ 能顯著調節糖尿病模型大鼠的糖代謝，其作用 機制 可能與 改善糖尿病模型大鼠肝臟細胞超微結構， 上調IRS- 2 介導的 GCK 表達，促進肝甘糖合成與貯存有關。關鍵詞桑葉多 糖； 糖尿病模型大鼠； 肝臟； 糖代謝； 葡萄糖激酶

（ 5）糖尿病是一種以高血糖為主要癥狀的內 分泌疾病， 目 前已成為繼心腦血管疾病和癌症之後的第 3 大疾病， 嚴重危害人類的健康。 已有研究表明， 許多植物多糖都具有降血糖作用， 且治療效果顯著， 毒副 作用 較小， 是治療糖尿病的 天然藥物。 桑葉多糖作為一種植物多糖， 經現代藥理學研究表明 其具有降血糖、 降血脂、 抗腫瘤、 抗衰老、抗凝血和 抑 菌 等 多 種 生 物 學 活 性 與 葯 理作。 MLPⅡ 是我們在前期研究從桑葉中分離用提純的一種均一多糖組分， 可明 顯改善糖尿病模型大鼠肝臟胰島素抵抗， 增強大鼠肝臟糖代謝功， 但其具體的 作用 機制尚 不明 確。 本研究能通過觀察組織細胞超微結構和檢測分析糖代謝相關蛋白質表達及基因 mRNA 轉錄水準， 進一步探討桑葉多糖 MLPⅡ 改善糖尿病模型大鼠肝臟糖代謝的作用 機制， 為臨床應用 桑葉多糖治療糖尿病提供理論依據。1材料與方法1． 1材料和主要試劑二級 雄 性 健 康 Wistar 大 鼠， 體 質 量 （ 270 ±10） g， 購自 北京維通利華動物實驗中心 。 動 物 基礎 飼 料、 高脂高糖飼料（ 20% 蔗糖，10% 豬油，2. 0% 膽固醇，0. 5% 膽酸鈉，67. 5% 基礎飼料） 購自 北京維通利華動物實驗中 心。 桑葉多 糖 MLPⅡ 由 本實驗室從桑葉中分離， 並採用 水提醇沉法， 經 DEAE- 52纖維素柱和 Sephadex G- 100 凝膠柱分離純化 製得， 其主要組成及摩爾比為 n（ 甘露糖） ∶ n（ 鼠李糖） ∶ n（ 葡萄糖） ∶ n（ 木糖） ∶ n（ 阿拉伯糖） = 8. 73 ∶1. 04 ∶ 6. 53 ∶ 2. 13 ∶ 1. 00〔6〕。 鏈脲佐菌素（ STZ） 、兔抗 GCK 多克隆抗體、兔抗 IRS- 2、兔抗 β-actin 多克隆抗體均購自 美國 Sigma 公司， 羊抗兔 IgG 二抗購自 美國 Rockland 公司， DAB 顯色劑購自 北京博奧森公司， Tiozol 購 自 美國 Invitrogen 公司， RT-PCR試劑盒購自 美國 Biomiga 公司。 PCR 引 物由 上海生工生物工程技術服務有限公司合成。1． 2糖尿病大鼠模型製備雄性大鼠給予高脂高糖飼料持續餵養 4 周後，禁食 12 h， 腹腔注射 STZ 溶液（ 劑量 35 mg/kg） 。繼續高脂高糖飼料餵養 1 周後， 禁食 12 h， 測定大鼠血糖值， 葡萄糖負荷 2 h 後血糖≥11. 1 mmol/L或空腹血糖≥ 7. 8 mmol/L 視為糖尿病大鼠造模成功。1． 3試驗分組與給藥方法隨機選取糖尿病模型大鼠 18 隻， 均分為 3 組：糖尿病模型對照組， 桑葉多糖 MLPⅡ 治療組和二甲雙胍陽性對照組。 另 取基礎飼料餵養體品質相同的大鼠 6 隻作為正常對照組。 各組大鼠每天灌胃 1次，持續灌胃 5 周。 其中給葯組每天給予桑葉多糖MLPⅡ （劑 量 150 mg/kg） 或 二 甲 雙 胍 （ 劑 量 100mg/kg），糖尿病模型對照組和正常對照組給予同等體積的 0. 154 mol/L NaCl 溶液。 試驗過程中正常對照組大鼠以基礎飼料餵養， 其餘各組大鼠均以高脂高糖飼料餵養。1． 4大鼠肝臟組織超微結構觀察各組大鼠經 1 g/L 戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉後打開腹腔，迅速取少許肝臟組織， 經 2. 5% 戊二醛固定液固定後再用 1% 鋨酸溶液固定， 脫水、 包埋、 超薄切片（ 50 nm） ， 醋酸鉛和醋酸鈾電子染色後， 用CM- 120 透射電子顯微鏡（ 荷蘭 Philips 公司） 觀察、拍照。1． 5大鼠肝臟組織糖代謝相關蛋白質表達及基因轉錄檢測1． 5． 1Western blot 檢測檢測葡萄糖激酶（ glucokinase， GCK） 和胰島素受體底物 2（ insulin receptor substrate 2， IRS- 2） 的蛋白質表達水準。 蛋白質樣品製備： 各組大鼠經 1 g/L 戊採用 Western blot 方法巴比妥鈉溶液腹腔麻醉後打開腹腔， 迅速摘取肝臟組織，稱取肝臟組織 50 mg 提取總蛋白， 採用 BCA法對蛋白 質濃度進行定量， 以 β-actin 作為內 參。 蛋白質上樣量 40 μg，10% SDS-PAGE 電泳， 轉膜， 封閉， 抗體孵育（ GCK 一抗1 ∶ 1 000，羊抗兔 IgG 二抗1 ∶ 2 000；IRS- 2 一抗 1 ∶ 1 000， 羊抗兔 IgG 二抗 1 ∶ 2 000） ， 採用化學發光法顯色，暗室 X 光膠片曝光， 採用 AlphaInnotech 軟體分析照片中蛋白質條帶的灰度值， 並計算各待測條帶與其相應內 參 β-actin 的 灰度值比值。1． 5． 2RT-PCR 檢測通過 RT-PCR 分析大鼠肝臟組織 GCK 和 IRS- 2 基因 mRNA 的轉錄水準。 大鼠肝臟組織樣品 獲取同「1． 5． 1 」。 取肝臟組織 100mg，參照文獻〔9〕 的 Triozol 法提取總 RNA， 定量後逆轉錄反應製備 cDNA。 按照逆轉錄試劑盒說明書 第 5 期任春久等： 桑葉多糖 MLPⅡ 對糖尿病模型大鼠糖代謝的改善作用969上步驟進行操作，20 μL 反應體系包括： M-AMV RT-5 × buffer 5 μL， 10 mmol/L dNTP mixture 1 μL， 40U/μL RNase inhibitor 1 μL， 200 U/μL M-AMV re-verse transcriptase 1 μL，0. 5 μg/μL oligo-dT（ 12 ～ 18）引物 1 μL， 2 μg/μL RNA 2 μL， DEPC ddH2O 9 μL。反應條件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。 以大鼠肝臟 cDNA 為模板進行 PCR 擴增。 GCK 基因擴增 的 上 遊 引 物 序 列 為 5"-ATCCTGCTCAACTG-GACCAA- 3"， 下遊引 物 序列 為 5"-CATTGCCACCA-CATCCATCTC- 3"，目 的片段長度為 120 bp； IRS- 2 基因擴增的 上遊引 物序列 為 5"-CAAGCAGATCCTG-CAGCCACG- 3"， 下 遊 引 物 序 列 為 5"-GTTCTCCAT-AGACAGCTTGGAG- 3"，目的片段長度為 196 bp〔10〕。25 μL PCR 反應 體系 包 括： cDNA 模板 1 μL， 10μmol/L 上、 下遊引 物各 0. 5 μL， PCR Mix 16 μL，ddH2O 6 μL。 GCK 基因擴增條件為：94 ℃ 預變性 3min；94 ℃ 變性 30 s，59 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 60s，循環 30 次；72 ℃ 延伸 5 min。 IRS- 2 基因擴增條件為：94 ℃ 預變性 3 min；94 ℃ 變性 30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 60 s， 循環 30 次；72 ℃ 延伸 5 min。擴增產物通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測， 採用GelDoc2000 凝膠影像分析系統進行觀察及影像採集，應用 Image J 軟體對電泳圖譜進行灰度分析， 以GCK/β-actin 與 IRS- 2 /β-actin 的灰度值比值分別表示 GCK 和 IRS- 2 基因 mRNA 轉錄水準。1． 6統計分析採用 SPSS 12. 0 統計分析軟體對試驗結果數據進行 t 檢驗或單因素方差分析， 數據以 珋 x ± s 表示，P ＜ 0. 05 為差異具有統計學意義。2結果與分析2． 1桑葉多糖 MLPⅡ 對糖尿病模型大鼠肝臟組織超微結構的影響各試驗組大鼠肝臟超微結構觀察結果見圖 1。正常對照組大鼠的肝臟細胞線粒體豐富、 飽滿， 多為圓形或卵圓形， 粗面內質網規則， 層狀排列， 甘糖顆粒豐富，分布於細胞質內（ 圖 1-A） ；糖尿病模型對照組大鼠的肝臟細胞胞漿內有大量脂滴， 線粒體腫脹，脊斷裂， 內 質網擴張、 脫顆粒且排列紊亂， 甘糖顆粒稀少（ 圖 1-B） ； 桑葉多糖 MLPⅡ 組和二甲雙胍陽性對照組大鼠的肝臟細胞內質網排列規則， 線粒體豐富、飽滿，細胞質內未見脂滴， 可見有大量的甘糖顆粒（ 圖 1-C、D） ， 細胞整體超微形態接近正常對照組。 結果表明，桑葉多糖 MLPⅡ 可明顯修復糖尿病模型大鼠肝臟細胞超微結構損傷， 促進甘糖合成和貯存。A． 正常對照組B． 糖尿病模型對照組C． 桑葉多糖 MLPⅡ 組D． 二甲雙胍陽性對照組n—細胞核，m—線粒體；白色箭頭所指為脂滴，黑色箭頭所指為內質網。A． Normal control groupB． Diabetic control groupC． MLPⅡ -treated groupD． Metformin-treated groupn—Nucleus， m—Mitochondria． The lipid droplet is indicated by white arrow． Endoplasmic reticulum is indicated by black arrow．圖 1桑葉多糖 MLPⅡ 對糖尿病模型大鼠肝臟細胞超微結構的影響Fig． 1Effects of mulberry leaf polysaccharide MLPⅡ on ultrastructure of liver cells of diabetic model rats2． 2桑葉多糖 MLPⅡ 對糖尿病模型大鼠肝臟組織GCK 和 IRS- 2 蛋白表達水準的影響對各試驗組大鼠肝臟組織中 GCK 和 IRS- 2 蛋白的 Western blot 檢測結果見圖 2。 以各待測條帶與其相應 β-actin 的灰度值比值做統計分析， 結果顯示，糖尿病模型對照組大鼠肝臟組織中 GCK 蛋白和IRS- 2 蛋白的表達水準與正常對照組相比明顯下調（ P ＜0. 05） ；而桑葉多糖 MLPⅡ 組大鼠肝臟組織的 970蠶業科學2013；39 （ 5）GCK 蛋白和 IRS- 2 蛋白表達水準與糖尿病模型對照組大鼠相比明顯上調（ P ＜ 0. 05） 。2． 3桑葉多糖 MLPⅡ 對糖尿病模型大鼠肝臟組織GCK 和 IRS- 2 基因轉錄水準的影響對各試驗組大鼠肝臟組織中 GCK 基因和 IRS- 2基因的 mRNA 檢測結果見圖 3。 以各待測條帶與其相應內參 β-actin 的灰度值比值做統計分析， 結果顯示，糖尿病模型對照組大鼠肝臟組織中 GCK 基因mRNA 和 IRS- 2 基因 mRNA 的轉錄水準與正常對照組大鼠相比明顯下調； 而桑葉多糖 MLPⅡ 組大鼠肝臟組織 GCK 和 IRS- 2 基因 mRNA 的轉錄水準與糖尿病模型對照組大鼠相比則明顯上調（ P ＜ 0. 05） 。1—正常對照組，2—糖尿病模型對照組，3—桑葉多糖 MLPⅡ 組，4—二甲雙胍陽性對照組* P ＜ 0. 05 表示與正常對照組相比；△P ＜ 0. 05、▲P ＜ 0. 05 均表示與糖尿病模型對照組相比。1—Normal control group， 2—Diabetic control group， 3—MLPⅡ -treated group， 4—Metformin-treated group．* P ＜ 0. 05 indicates results compared with normal control group；△P ＜ 0. 05 and ▲P ＜ 0. 05 indicate results compared with diabetic control group．圖 2Western blot 檢測桑葉多糖 MLPⅡ 對糖尿病模型大鼠肝臟組織 GCK 和 IRS- 2 蛋白表達的影響Fig． 2Effects of mulberry leaf polysaccharide MLPⅡ on protein expression of GCK and IRS- 2in liver tissue of diabetic model rats measured by Western blot1—正常對照組，2—糖尿病模型對照組，3—桑葉多糖 MLPⅡ 組，4—二甲雙胍陽性對照組。* P ＜ 0. 05 表示與正常對照組相比；△P ＜ 0. 05、▲P ＜ 0. 05 均表示與糖尿病模型對照組相比。1—Normal control group， 2—Diabetic control group， 3—MLPⅡ -treated group， 4—Metformin-treated group．* P ＜ 0. 05 indicates results compared with normal control group；△P ＜ 0. 05 and ▲P ＜ 0. 05 indicate results compared with diabetic control group．圖 3RT-PCR 檢測桑葉多糖 MLPⅡ 對糖尿病模型大鼠肝臟組織 GCK 和 IRS- 2 基因 mRNA 轉錄的影響Fig． 3Effects of mulberry leaf polysaccharide MLPⅡ on transcription levels of GCK andIRS- 2 mRNA in liver tissue of diabetic model rats measured by RT-PCR 第 5 期任春久等： 桑葉多糖 MLPⅡ 對糖尿病模型大鼠糖代謝的改善作用9713討論糖代謝紊亂是糖尿病、 肥胖和非酒精性脂肪肝等代謝綜合症的重要病理生理學基礎， 也是糖尿病患者血糖失衡的重要原因， 調節糖代謝、 維持血糖平衡是治療糖尿病的一個重要途徑。 肝臟是糖代謝的重要器官， 其通過調節肝甘糖的合成和分解，維持人體血糖的動態平衡。 為此， 本研究以大鼠肝臟為研究材料， 探討桑葉多糖 MLPⅡ 對糖尿病模型大鼠肝臟糖代謝的調節作用， 具有一定的理論與實用意義。細胞是生命活動的基本單元， 而細胞超微結構的完整是細胞行使其生理功能的基礎。 本研究對肝細胞超微結構的觀察結果顯示， 糖尿病模型組大鼠肝細胞超微結構損傷嚴重， 胞漿內 甘糖顆粒稀少；而桑葉多糖 MLPⅡ 組大鼠肝細胞超微結構明顯改善，肝甘糖含量明顯增加。 這表明桑葉多糖 MLPⅡ 能改善糖尿病大鼠肝臟超微結構， 促進肝甘糖的合成與貯存。 在觀察中還發現， 桑葉多糖 MLPⅡ 組大鼠肝臟細胞中脂滴含量明顯減少， 提示桑葉多糖MLPⅡ 對糖尿病模型大鼠脂代謝也有調節作用， 而且脂滴的消溶減輕了其對肝臟亞細胞結構的擠壓，這也可能是細胞超微結構改善的原因之一。 前期研究中曾用蒽酮比色法測得桑葉多糖 MLPⅡ 能明顯提高糖尿病模型大鼠肝甘糖含量， 本研究結果與之一致。肝甘糖的合成受到多種蛋白質的調控， 而 GCK在其合成過程中起到關鍵作用。 葡萄糖激酶是己糖激酶家族成員， 最初發現其在肝細胞中表達， 之後發現在胰島 β 細胞、 神經元和腦垂體中也有表，它是糖代謝的限速酶， 在人體糖代謝中起達重要作用。 在肝臟中， 當 機體空腹或血糖水準低時，GCK 儲存在細胞核中， 其活性較低， 此時肝甘糖輸出增加， 以保證機體重要器官的能量供應； 而當餐後或血糖水準高時， GCK 從細胞核轉位至胞漿中且活性 增 強， 催化 葡萄 糖磷酸化 為 6-磷酸 葡萄，從而促進肝甘糖合成，抑製糖異生， 以降低血糖水準。 本研究發現桑葉多糖 MLPⅡ 治療組糖尿病模型大鼠肝臟 GCK 蛋白表達及其基因 mRNA轉錄水準比糖尿病模型對照組大鼠分別增加 97. 10%和 28. 28% ，表明桑葉多糖 MLPⅡ 可明顯上調糖尿病模型大鼠肝臟組織中 GCK 的表達，特別是對 GCK糖蛋白質翻譯過程的調控作用更為明顯， 提示糖尿病模型大鼠肝甘糖含量增加可能與 GCK 的表達上調有關。 Li 等發現用 1-脫氧野尻黴素（ DNJ） 與桑葉多糖的混合物可提高四氧嘧啶誘導的糖尿病模型小鼠肝臟中 GCK 基因 mRNA 的轉錄水準。 本研究採用桑葉多糖單體， 同樣可提高糖尿病大鼠肝臟中 GCK 基因 mRNA 的轉錄水準，進一步證實了桑葉多糖具有促進糖尿病模型大鼠肝臟 GCK 表達的作用。有研究表明，肝臟中 GCK 的表達受胰島素水準的調節，當血糖水準上升時， 胰島素分泌增多、 作用增強，GCK 活性亦增強。 因此， 我們推測由於糖尿病模型大鼠的肝臟存在胰島素抵抗而導致胰島素作用下降，可能是肝臟中 GCK 活性減弱的一個重要原因。 胰島素受體底物（ insulin-receptor substrat，IRS） 是細胞質中連接胰島素受體和各種效應分子的接頭蛋白，處於胰島素受體後信號傳導通路的中心位置， 在肝臟等胰島素作用 的靶組織中廣泛表達。 彭定瓊等發現在大鼠肝臟胰島素信號傳導中，IRS- 2 比 IRS- 1 可能具有更重要的生理作用。 據此，本研究又進一步檢測了 IRS- 2 的表達變化。 結果顯示，桑葉多糖 MLPⅡ 能明顯上調糖尿病大鼠肝臟 IRS- 2 蛋白表達及其基因 mRNA 的轉錄水準， 表明桑葉多糖 MLPⅡ 可通過上調 IRS- 2 的表達誘導GCK 表達增加。綜上所述，桑葉多糖 MLPⅡ 可通過改善糖尿病模型大鼠肝臟細胞超微結構， 上調 IRS- 2 的表達以及誘導 GCK 的表達， 進而促進肝甘糖合成與貯存，最終起到調節糖代謝的作用。