Cancer Cell | 利用高通量單細胞解析度3D圖像技術研究乳腺腫瘤內克隆可塑性

撰文 | 覺主在路上

責編 | 兮

腫瘤細胞在生長過程中，經過多次分裂增殖，其子細胞呈現出基因和（或）形態改變的特性被稱作腫瘤異質性（heterogeneity），這種特性產生的主要機制包括克隆進化模型（隨機獲得並積累基因突變從而產生適應性更強的細胞克隆）、腫瘤乾細胞模型（具有乾細胞特質的腫瘤細胞克隆進行自我更新和多分化）和腫瘤微環境模型（對腫瘤特定區域產生不同的選擇壓力），這些機制也可同時發生在同一腫瘤當中【1】。腫瘤異質性表現在腫瘤內部產生生長速度、侵襲能力、對藥物的敏感性等各方面存在差異的子細胞克隆，這些子細胞克隆可存在於腫瘤內不同區域，並會處於不斷的動態變化過程當中。在這個動態變化過程當中，腫瘤子細胞克隆呈現複雜的表型變化，並伴隨多種生物學功能的差異的特性被稱為腫瘤細胞可塑性。上皮細胞間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和腫瘤乾細胞(cancer stem-like cell, CSC) 表型變化是腫瘤細胞可塑性的兩個重要表現【2】。

腫瘤治療策略的制定因為腫瘤的異質性變得更加複雜，腫瘤治療不能僅只針對某個基因或信號通路，還要隨時針對治療過程中產生的新細胞克隆【3】。因此，獲取每個腫瘤子細胞克隆和全腫瘤空間異質性的全部信息變得尤為重要。而高解析度3D成像技術聯合免疫熒遊標記技術能夠展現整個腫瘤內子細胞克隆多樣性及分布。為了獲得最佳圖像，腫瘤樣品製備過程，尤其對透明技術具有較高要求。而目前使用的透明技術或是需要較長時間和多重步驟 【4】，或是透明過後組織有明顯的皺縮或結構變形【5】。

近日，來自澳大利亞The Walter and Eliza Hall 研究所的Jane E. Visvader教授團隊開發了一種快速、高通量單細胞解析度3D成像技術（Large-scale Single-cell Resolution 3D imaging， LSR-3D）操作方法，聯合多顏色譜系示蹤技術和RNA測序技術，對乳腺腫瘤內細胞可塑性進行了研究。該成果以Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging為標題發表在了Cancer Cell上。

研究人員首先對乳腺組織透明方法進行了研究探索。在對組織進行固定和熒遊標記之後，使用包含以果糖、尿素和甘油為透明試劑（FUnGI）的方法（LSR-3D）進行成像，該方法優點是無毒性，簡單快速，室溫下透明時間僅需2小時，乳腺組織結構保存完整，細胞特異性組織標記清晰可見，透明過後的組織也可在-20C下完整保存至少18個月。

接下來，研究人員將LSR-3D與多顏色熒光報告系統Rosa26R-confetti【6】相結合，研究乳腺癌變過程中子細胞克隆的動態變化。研究人員對基因工程小鼠使用外源化學致癌誘導劑（某基因-rtTA/TetO-cre/R26R-confetti）和體內Trp53和Pten基因突變（某基因-rtTA/TetO-cre/Ptenf/f/Trp53f/f/R26R-confetti）兩種方法誘導其腫瘤發生，並對Krt5標記的基底層細胞和Elf5標記的管腔祖細胞分別進行譜系追蹤發現，在癌變過程中，基底細胞會產生大量管腔細胞克隆，這些克隆隨著癌變進程進行大量擴增，證明管腔祖細胞可以直接參與早期癌變的發生。

為了了解乳腺腫瘤內不同克隆之間分子水準的變化，研究人員進一步對小鼠（某基因-rtTA/TetO-cre/Ptenf/f/Trp53f/f/R26R-confetti）內腫瘤不同顏色單細胞克隆使用FACS篩選富集，同時進行CD29（管腔層細胞標誌）和CD24（基底層細胞標誌）染色，進一步RNA測序分析。測序結果顯示，不同腫瘤內不同細胞克隆（熒光顏色）可具有不同比例的基底和管腔細胞；在所有檢測的腫瘤當中發現，大部分腫瘤子細胞克隆中都有一群高表達間質細胞特性基因（EMT轉化）的細胞，並佔有較大比例，從而證明了腫瘤細胞在分化過程中具有不穩定性/可塑性。

這項研究的重要意義在於，開發了基於透明介質FUnGI的高通量3D實體瘤成像技術（LSR-3D），使得高解析度全組織成像技術變得更加簡單、快速，組織保存更加完整，圖像更加清晰；通過結合譜系示蹤和RNA測序技術，發現了乳腺腫瘤子細胞克隆主要起源於管腔祖細胞，且這些腫瘤子細胞克隆頻繁發生EMT，從而推進乳腺腫瘤細胞癌變的發生發展。本研究同時從圖像和分子水準展示了乳腺癌癌變過程中腫瘤細胞的發生和發展過程。

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製版人：半夏

參考文獻

1. Lawson, Devon A., et al. "Tumour heterogeneity and metastasis at single-cell resolution." Nature cell biology 20.12 (2018): 1349.

2. da Silva-Diz, Victoria, et al. "Cancer cell plasticity: Impact on tumor progression and therapy response." Seminars in cancer biology. Academic Press 2018.

3. Dagogo-Jack, Ibiayi, and Alice T. Shaw. "Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies." Nature reviews Clinical oncology 15.2 (2018): 81.

4. Richardson, Douglas S., and Jeff W. Lichtman. "Clarifying tissue clearing." Cell162.2 (2015): 246-257.

5. Lloyd-Lewis, Bethan, et al. "Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods."Breast Cancer Research 18.1 (2016): 127.

6. Snippert, Hugo J., et al. "Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells." Cell 143.1 (2010): 134-144.

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