Nat Comm │王紅霞團隊揭示乳腺癌乾細胞調控新機制

責編丨迦漵

腫瘤是一高度異質性疾病，由大多數已分化腫瘤細胞和極少數具自我更新潛能的腫瘤乾細胞（Cancer Stem Cells, CSCs）組成。CSCs是對傳統治療具有抵抗的一群處於「靜息狀態」的細胞，也是腫瘤轉移和複發的根源。儘管CSCs在腫瘤進展、轉移與耐葯中的核心作用已得到認可，但對其精細調控分子機制仍有待進一步深入。

2019年6月28日，Nature Communications在線發表了上海市第一人民醫院王紅霞團隊的研究成果「TSPAN8 promotes cancer cell stemness via activation of sonic Hedgehog signaling」。

Tetraspanins又稱作四次跨膜蛋白超家族(TM4SF)，由33個家族成員組成，包括TSPAN8、與分化（CD）相關的CD63、CD37、CD53、CD81和CD9等。Tetraspanins家族共同特徵是具有四個高度保守的膜跨域，在多種細胞功能中發揮重要生物學調控。越來越多證據表明，TSPAN8調控多種人類腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移能力，包括卵巢癌和消化道腫瘤、肝癌、胰腺癌和膠質瘤等，然而其具體分子機制仍不清楚。

王紅霞團隊近年來一直聚焦四次跨膜蛋白生物學功能調控的多樣性及與腫瘤進展的關係開展系列性研究工作。這篇文章報告了前期研究成果：TSPAN8通過與PTCH1相互作用，增強PTCH1與SHH結合、解除PTCH1對SMO的抑製。此外，TSPAN8招募ATXN3去泛素酶來進一步穩定SHH/PTCH1聯合複合體、抑製蛋白酶體介導的降解。穩定的SHH/PTCH1促進了GRK2蛋白激酶與SMO的結合，隨後SMO磷酸化、SMO發生纖毛易位以及調控下遊基因表達的GLI1激活。

本文發現的主要要點如下：

1） TSPAN8在CSCs中表達上調，與乳腺癌患者治療抵抗和不良預後相關。

研究者對乳腺癌原代細胞採用三維立體培養富集CSCs和貼壁培養分化細胞並行微陣列分析，顯示TSPAN8在CSCs中顯著上調。免疫熒光分析揭示TSPAN8和ALDHA1在微球體中一致性過表達。TSPAN8+ 細胞Nanog和Oct4表達增強，乾性表型百分比顯著增高。TSPAN8過表達顯著增強Sox2、Oct4、Nanog和ALDHA1的mRNA和蛋白表達。這些結果均表明TSPAN8表達與腫瘤乾細胞表型有關。臨床組織標本檢測表明TSPAN8在三陰性乳腺癌TNBC中表達顯著升高，且與患者總生存時間呈負相關，TSPAN8過表達患者對於新輔助化療敏感性差，與治療抵抗相關。

2）TSPAN8通過激活Sonic Hh信號傳導參與腫瘤細胞乾性維持

研究者在一系列腫瘤細胞株中過表達TSPAN8，發現乾性增強，表現為微球體大小和數量增多、集落形成能力增強以及CD44+/CD24-細胞比例增加，並促進細胞對化療藥物阿黴素（ADR）和紫杉醇（PTX）的抵抗性。為評估TSPAN8通過哪一種關鍵信號途徑發揮這一調控作用，研究者在腫瘤細胞中過表達TSPAN8，發現顯著增加了PTCH1，GLI，HHIP和SHH（Hh信號通路）mRNA與蛋白表達、SMO磷酸化和GLI1轉錄活性增高。Hedgehog途徑抑製劑Vismodegib和RU-SKI43處理可逆轉這一現象。

3）TSPAN8通過募集ATXN3來穩定PTCH1與SHH複合物，進而誘導SMO磷酸化、纖毛易位，調控Sonic Hedgehog信號激活。

免疫共沉澱與GST-pulldown顯示TSPAN8直接與PTCH1結合併促進SHH和PTCH1共定位。為明確TSPAN8上調SHH和PTCH1的機制，採用放線菌素D與蛋白質合成抑製劑環己醯亞胺（CHX）處理顯示TSPAN8過表達通過延長兩種蛋白質的半衰期來穩定PTCH1和SHH表達。這些結果提示TSPAN8可能通過抑製蛋白酶體依賴性降解來增強PTCH1和SHH複合物穩定性。通過免疫沉澱質譜分析，研究者鑒定了ATXN3去泛素化酶能與TSPAN8與PTCH1相互作用；TSPAN8促進ATXN3與PTCH1結合來穩定PTCH1與SHH複合物表達，同時招募GRK2蛋白激酶與SMO的結合和磷酸化，促進SMO纖毛定位。

4）TSPAN8過表達腫瘤形成能力增強。臨床上TSPAN8、SHH、PTCH1和ATXN3表達呈正相關性，高ATXN3表達與腫瘤患者不良預後相關。

將患者腫瘤標本中分離的原代腫瘤細胞注射到NOD / SCID小鼠原位接種以進行有限稀釋測定，TS+ 細胞比TS- 細胞組小鼠存活時間縮短。與TS細胞（1：873,532）相比，TS +細胞中乾細胞比例顯著增加（1：10,639）。TSPAN8過表達細胞腫瘤形成能力增強受到ATXN3 shRNA的抑製。

總的來說，本項研究揭示了新的TSPAN8激活Sonic Hedgehog信號通路分子機制，揭示了TSPAN8通過調控腫瘤細胞乾性從而促進腫瘤複發轉移與耐葯的作用機制。

據悉，浙江大學醫學院轉化醫學研究院呂志民教授為本文共同通訊作者。朱容萱和Olivier Gires為共同第一作者。

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