B肝工程核酸酶研發前景，技術改良後，可以提高小鼠特異性_Fokl

然而，研究人員發現左/左或右/右同源二聚體也可以組裝，從而在這些非預期位點進行功能性Fokl二聚化和切割。為了限制這種可能性，第二代和第三代Fokl核酸酶結構域，被確定為僅在發生左/右異二聚化時才起作用。例如，Q486E與 I499A和E490K以及 I538V一起產生的 ZFN 單體作為同二聚體的作用很差，但作為異二聚體卻非常有效。

隨後一項研究確定了FokI 核酸酶結構域的其他修飾，例如 ELD（Q486E、I499L、N496D）和 KKR（E490K、I538K、H537R）突變，從而產生了改進的專性異二聚體 ZFN 。研究人員還確定了增強Fokl核酸酶結構域催化活性和提高ZFN功效的修飾。這些所謂的Sharkey 突變（S418P 和 K441E）也可以減少核酸酶的脫靶突變，因為需要較低的劑量才能產生治療效果。

在這裡，我們評估了第二代TALEN（Q486E、I499A、E490K 和 I538V 專性異二聚體）以及具有 Sharkey 突變的第三代 TALEN（ELD 和 KKR 專性異二聚體）用於抗 HBV 的用途。總體來說，第二代專性異源二聚體的療效與最初的第一代抗HBV TALENs的療效相當。儘管觀察到靶向核心ORF的第二代專性異二聚體 TALEN 對病毒複製的抑製水準相似，但在體內觀察到較低的靶標破壞！

相比之下，含有Sharkey 突變的第三代 TALEN 對 HBV 的沉默活性降低，這一結果與此前已有報導結果類似，這表明將Sharkey 突變納入TALEN結構，更具體地說，納入第三代Fokl核酸酶結構域，對沉默活性有害。Sharkey突變是由 ZFN 的定向進化產生的，可能是TALEN內沉默活性降低的原因。

小番健康結語：南非和德國研究人員發表的這項研究，是在說明這種工程核酸酶技術（如TALEN），具有直接靶向和滅活cccDNA的能力，這種能力使得TALEN成為一種值得探索的慢性HBV感染治療方法。TALEN和Cas9功能，已被證明受異染色質限制。最近數據表明，TALENs在導航緊密DNA方面的表現優於Cas9核酸酶。

這些研究發現在HBV治療領域很重要，因為cccDNA已被證明以異染色質狀態存在。雖然TALEN被異染色質阻礙，但其活性並未完全受到抑製，並且核酸酶能夠在異染色質內導航，比Cas9核酸酶更是如此，Cas9核酸酶在詢問目標位點之前必須分離雙鏈DNA。病毒DNA的有效靶向依賴於TALEN與靶序列的結合，這可能會被逃逸突變破壞。

HBV測序數據的分析確定了描述TALEN靶位點的有限變異性。此外，需要同時靶向HBV基因組內的多個位點來限制病毒逃逸。脫靶效應的表征和TALEN表達序列的有效傳遞載體開發，對於該技術最終臨床轉化仍然至關重要。TALEN技術可以很好地填補抗HBV療法的重大空白。

解讀TALEN技術研發特點和前景

目前醫學知識進展至今，發現慢性HBV感染持續性源自於病毒cccDNA，它在感染過程中被確立為穩定的附加型微染色體。實現功能性治愈HBV，包括完全抑製cccDNA活性，這一目標越來越被認為是能夠實現的目標，而不是必須完全清除所有病毒庫的滅菌治愈。工程核酸酶技術，有可能直接靶向cccDNA，並誘導破壞性突變來永久滅活這種病毒中間體。

研究已於2021年7月12日由南非威特沃特斯蘭德大學、德國弗萊堡大學醫學中心研究人員發表在科學雜誌《Viruses》上。返回搜狐，查看更多