HBV cccDNA的體外細胞模型和實驗小鼠模型

蘇瑜, 朱園飛, 田青右, 謝幼華, 鄧強

復旦大學醫學分子病毒學重點實驗室

HBV慢性感染迄今仍然是世界性公共健康問題，研究HBV病毒學機制、發展有效的抗病毒治療策略具有重要的科學意義和社會意義。HBV是一種小的DNA包膜病毒，屬於嗜肝DNA病毒科，成熟粒子中含有約3.2 kb鬆弛環狀DNA（rcDNA）基因組。在病毒感染的肝細胞核內，rcDNA修復為共價閉合環狀DNA（cccDNA），是病毒轉錄複製的原始模板。cccDNA轉錄的病毒前基因組RNA（pgRNA）在細胞漿內包裝入核衣殼，通過反轉錄起始病毒DNA合成，成熟的病毒核衣殼顆粒再次轉運至細胞核，完成細胞內的病毒複製周期。

HBV cccDNA通過從頭感染的病毒粒子或細胞漿內新合成核衣殼粒子中的rcDNA修復而成。病毒雙鏈線性的DNA複製中間體則可能通過非同源末端聯接方式形成非功能性的cccDNA。rcDNA修復生成cccDNA的分子機制尚不是很清楚，通常認為包括正鏈補齊，去除共價結合的病毒多聚酶蛋白和其他冗餘成分，以及最終完成DNA末端連接等步驟。rcDNA修復生成的cccDNA具有超螺旋結構，並結合組蛋白等形成串珠樣核小體結構的微小染色體，具有顯著的表觀遺傳學修飾特徵。cccDNA生物合成是HBV複製過程中的限制性步驟。在慢性感染者的肝穿刺樣本中，每單個肝細胞中平均約含有0.01~1.4拷貝，或者0.1~9.0拷貝的cccDNA。儘管較低的拷貝數，細胞內cccDNA卻具有顯著的穩定性，是HBV持續感染的分子基礎。cccDNA在抗病毒藥物抑製條件下仍具有較長的代謝周期，能通過縱橫諜海傳遞至子代細胞，細胞凋亡或壞死是其體內代謝的主要途徑。現有的抗病毒藥物能有效抑製病毒複製和rcDNA形成，但難以清除cccDNA，是HBV慢性感染患者難以徹底治癒的根本原因，也因此代表了抗病毒藥物研發的關鍵靶點。

在過去的數十年中，儘管HBV研究領域獲得了令人矚目的成就，但對HBV cccDNA形成、維持和降解等代謝機制仍缺乏深入細緻的了解。HBV cccDNA相關研究常常受製於缺乏合適的實驗模型和簡單可靠的檢測方法。HBV檢測技術在本期的其他論文中有詳細描述，本文將圍繞近年來HBV cccDNA體外細胞模型和實驗小鼠模型的重要進展進行綜述和分析。

1 cccDNA研究的體外細胞培養模型

1.1 病毒感染細胞模型

原代肝細胞模型

分化的原代人肝細胞（PHH）能夠被HBV感染，由於其正常（非腫瘤）的細胞特性，適合於對病毒宿主相互作用的研究，尤其是宿主細胞抗病毒天然免疫機制的研究。例如，應用HBV體外感染PHH模型的研究發現，HBV感染呈現一種所謂「隱蔽」方式，並不激活宿主細胞天然免疫機制，同時也不產生對其他共感染病毒的抑製，因此證實了早先基於黑猩猩體內感染模型的研究結果。Lucifora等則報導α干擾素能夠誘導APOBEC3A和3B在肝細胞中的表達，後者通過胞嘧啶脫氨基作用實現對HBV cccDNA的修飾和清除。表觀遺傳學研究則顯示α干擾素顯著抑製病毒感染PHH細胞中cccDNA的轉錄活性。有意思的是，沉默的染色質結構特徵似乎提示cccDNA穩定性的增加。

PHH是研究HBV感染最貼近自然的細胞模型，然而，PHH不易獲得，增殖緩慢，且難以在體外維持其分化狀態，在接種後不久就會失去病毒易感性。Ortega-Prieto等最近報導了一種改進的三維（3D）微流體PHH體外培養系統，能夠長期穩定表達特定的肝細胞基因（＞40 d），且能夠在極低的感染複數條件下實現對PHH的感染。與其他HBV體外感染體系不同，3D 培養PHH模型中HBV起始和維持感染並不依賴二甲基亞碸和聚乙二醇。病毒感染21 d後，每個PHH細胞中可檢測到約2拷貝的cccDNA，α干擾素處理細胞不能抑製cccDNA形成。值得注意的是，應用特定培養基可誘導PHH去分化，使其獲得體外大量增殖的能力；基於3D球狀培養重新誘導分化的細胞具有PHH的主要特徵，並支持HBV感染和cccDNA形成。Fu等研究發現，HBV感染的PHH去分化擴增後不能檢測到cccDNA以及病毒抗原表達，但重新誘導分化的PHH樣細胞出現HBV病毒學反彈，cccDNA水準顯著增高，提示cccDNA能夠通過縱橫諜海大量遺失，卻並不能完全清除。以上這些PHH模型的研究進展，如具有較好的重複性和可行性，必將極大推動HBV病毒學和cccDNA相關研究。

肝腫瘤細胞模型

HepaRG細胞最初從HCV感染相關肝腫瘤樣本中篩選和發展獲得，能夠在二甲基亞碸和氫化考可地松誘導分化條件下獲得HBV感染能力，並表達肝細胞特徵性蛋白。由於首次報導肝腫瘤細胞系支持HBV從頭感染，隨後十多年中成為HBV研究領域最炙手可熱的研究工具之一。HepaRG模型實驗條件較為苛刻，通常需要4周的培養分化時間，且依賴較高的病毒細胞感染複數以實現感染。應用HepaRG感染體系的研究顯示，HBV從頭感染動力學過程緩慢，rcDNA修復為cccDNA的效率較低，建立感染後cccDNA拷貝數並不出現顯著擴增。應用桿狀病毒系統攜帶HBV基因組轉導HepaRG細胞，誘導顯著的Ⅰ型干擾素應答，抑製和清除HBV在HepaRG細胞中的複製，這一結果似乎與前文提及的HBV「隱蔽」感染的特徵並不一致，推測與桿狀病毒載體特徵相關。

HepG2和Huh7細胞系是最常用的肝癌細胞系，能夠支持基於HBV DNA複製子模板的病毒複製，且易於遺傳學操作。然而由於缺乏病毒進入受體，它們都不被HBV感染。牛磺膽酸鈉協同轉運多肽（NTCP）已被證明是HBV和HDV的高親和力受體，穩定表達外源性NTCP使得HepG2和Huh7細胞能夠被HBV感染，應用Southern blot雜交分析能夠檢測到cccDNA形成。基於HepG2NTCP體外感染系統，Qi等應用siRNA篩選證實，宿主DNA多聚酶κ可能是cccDNA修復過程中正鏈缺口補齊的主要分子機制；特異性敲低DNA連接酶1或3的表達，能夠顯著抑製HBV cccDNA的形成，提示宿主DNA修復機制在HBV cccDNA生物合成過程扮演了重要角色。由於尚不清楚原因，小鼠肝臟細胞並不支持cccDNA形成。表達人NTCP的小鼠肝腫瘤細胞系，或表達人NTCP的轉基因小鼠，並不能支持HBV的從頭感染。Cui等最近報導在HBV誘導表達的小鼠AML12HBV10細胞系中鑒定到cccDNA，並發現AML12HBV10細胞中成熟的病毒核衣殼粒具有顯著的不穩定性。

1.2 cccDNA從頭合成的轉染細胞模型

應用攜帶線性HBV基因組複製子的質粒轉染肝腫瘤細胞系HepG2或Huh-7，能夠在細胞中產生病毒RNA和DNA複製中間體，後者在細胞核內進一步修復成為cccDNA。瞬時轉染的優勢在於質粒DNA自身可看做是一種cccDNA替代分子，但這一模型新產生的野生cccDNA拷貝數極低。鴨乙型肝炎病毒（duck hepatitis B virus, DHBV）在病毒基因構成等方面與HBV具有較大的相似性，因此作為模型系統被廣泛地用於HBV病毒學研究。值得注意的是，應用敲除包膜蛋白基因的DHBV複製子質粒轉染雞肝腫瘤細胞系LMH，每單個細胞中平均能夠產生約200~400分子的cccDNA。然而在HBV質粒中敲除包膜蛋白基因並不能產生類似效應。進一步的研究顯示，HBV和DHBV自身病毒學因素決定了cccDNA從頭合成的效率，而宿主細胞種系特徵並不顯著。

另一方面，研究者發展了HBV DNA穩定轉染的細胞系，最為著名的是HepG2.2.15和HepAD38細胞系，前者在宿主細胞基因組中整合併穩定表達HBV基因組，後者則應用四環素（tetracycline, tet）表達調控體系（tet-off）誘導HBV pgRNA和HBcAg的表達。相對於HepG2.2.15細胞系，tet-off誘導表達的HepAD38細胞中病毒複製和cccDNA形成更為顯著，易用Southern雜交等方法檢測，是HBV cccDNA研究的重要工具之一。為實現基於細胞模型的抗病毒藥物高通量篩選，Guo等巧妙地發展了HepDE19細胞模型，研究者設計構建tet-CMV啟動子控制的HBV基因組編碼質粒，其5』端刪除HBeAg的翻譯起始碼；正鏈DNA合成實現模板轉換並修復為cccDNA後，HBeAg則獲得完整蛋白的讀碼框，其分泌產物因此可指示cccDNA的從頭合成。由於HBeAg蛋白質序列與HBcAg大部分重合，研究者進一步在其N端（epsilon序列後）設計融合了一段（9 aa）HA標籤序列，證實並不影響HBV複製。

1.3 病毒複製子轉染細胞模型

線性複製子模型

HBV相關體內、體外研究中多採用線性化的病毒複製子系統，即質粒或重組病毒載體編碼部分重複或多拷貝串聯重複的HBV病毒基因組。在轉染細胞中，線性複製子編碼質粒可替代cccDNA模板起始病毒複製周期，並從頭合成野生型cccDNA。質粒複製子系統的優勢在於分子生物學操作的便利性，可廣泛應用於HBV病毒突變體的研究。由於具有較大的基因組長度、以及攜帶大量的外源性片段（例如原核特徵的質粒複製和抗性篩選元件等），DNA質粒或重組病毒載體可能具有與3.2 kb HBV cccDNA顯著不同的病毒學特徵和宿主反應性。Günther 等應用HBV單拷貝基因組DNA（PCR或多拷貝串聯基因組的酶切產物）轉染肝腫瘤細胞系，具有黏性末端的線性DNA轉染細胞後，通過細胞內修復機制環化，成為HBV轉錄和複製的替代模板，進而由病毒的細胞內複製機制從頭合成cccDNA。這一模型簡便易行，早期HBV cccDNA表觀遺傳學的一些重要研究正是基於該模型展開的。然而，線性DNA環化機制和效率並不清楚，環化的DNA模板與新生cccDNA的區分也比較模糊。在最近的報導中，Bogomolov等應用T4連接酶連接線性的病毒DNA基因組，通過瓊脂糖電泳和膠純化獲得具有超螺旋結構特徵的cccDNA替代分子。

HBV重組cccDNA（rcccDNA）模型

本課題組實驗室在研究中發展了一種通過位點特異性重組獲得rcccDNA的策略。rcccDNA與野生病毒cccDNA具有較大相似性，能夠在細胞內或體外系統大量誘導產生，是HBV病毒學研究的一類重要工具。HBV基因組高度壓縮，難以容納外源性序列。作者在HBV基因組兩側引入同向loxP位點，由重組酶Cre引發loxP位點之間的DNA重組和環化，生成含有單拷貝loxP位點的rcccDNA；loxP位點則位於一段約90 bp的外源性內含子中（HBsAg基因近5』端），可在RNA轉錄過程中移除，實現所謂的無縫插入。另一方面，作者基於大腸桿菌PhiC31重組酶誘導表達系統，建立了一種體外誘導rcccDNAattR微環產生和純化的策略。純化的rcccDNAattR微環具超螺旋結構，能夠支持功能性的HBV複製和抗原表達。值得指出的是，由於rcccDNA編碼的外源內含子序列，應用引物特異性PCR方法易於與HBV DNA複製中間體、以及從頭合成的新生cccDNA區分。由於首次建立HBV rcccDNA體外培養細胞模型，這一工作受到了廣泛關注。羅氏研發團隊的報導中將39 bp的attR位點設計插入在HBV多聚酶基因的spacer區（PreS1起始密碼子前），顯示並不影響病毒複製。Li等則將Gaussia熒光素酶報告基因插入到HBcAg編碼框中，應用體外微環DNA重組和純化技術獲得rcccDNAattR，並證實能夠在轉染Huh-7細胞中產生子代病毒。儘管大片段外源基因插入cccDNA是否支持病毒複製具有爭議，上述cccDNA替代分子的研究無疑為高通量藥物篩選提供了一個快速、靈敏的體外測試平台。

2 cccDNA研究的實驗小鼠模型

2.1 人肝細胞嵌合小鼠模型

小鼠是生物學研究中最為廣泛應用的模式動物，然而HBV並不感染小鼠肝臟細胞，如前文所述，表達人NTCP蛋白的小鼠肝臟細胞並不支持HBV從頭感染和cccDNA形成。Rhim等首先報導了一種基於尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑（uPA）轉基因的肝細胞嵌合小鼠模型。uPA具有肝細胞毒性，將 uPA 轉基因小鼠與嚴重聯合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠）雜交後，異源移植的肝細胞具有顯著的生長優勢，因此可建立易感 HBV 的人源化肝臟。延胡索醯乙醯乙酸水解酶（FAH）基因敲除是另一種常見的人肝細胞嵌合鼠模型策略。FAH 基因敲除會導致酪氨酸代謝產物的累計和肝細胞死亡，2-硝基-4-三氟甲苯-1，3環己二酮則能特異性地阻斷上述過程，維持FAH敲除小鼠的生存。在免疫缺陷的FRG（Fah–/–Rag2–/–Il2rg–/–）小鼠模型中，人肝細胞的比例甚至可高達95%。

人肝細胞嵌合小鼠模型對cccDNA生物學特徵的研究具有重要意義。Volz等應用uPA/SCID小鼠模型的研究發現HBV建立感染是一個緩慢的過程；在進入感染擴增期後，應用進入抑製劑Myrcludex-B甚至抑製了cccDNA池的擴增，提示後者更多來自於病毒的從頭感染，病毒細胞內複製的補充作用則並不明顯。非常有意思的是，來自同一課題組最近的研究發現：（1）HBV感染的PHH在uPA/SCID小鼠體內增殖的能力減弱；（2）隨著病毒感染細胞在體內的增殖，cccDNA被逐漸稀釋且出現部分「丟失」。儘管這種「丟失」的相關分子機制並不清楚，這一發現為發展有效的抗病毒策略以清除cccDNA找到了「阿喀琉斯之踵」；（3）此外，HBV感染的極少部分PHH細胞缺乏增殖潛力，可能代表了cccDNA在體內穩定存在的儲存庫。這一研究代表了近期HBV研究領域的一項重要成果，為發展HBV治癒性策略提供了新的線索和思路。

2.2 應用高壓水動力注射的體內轉染小鼠模型

基於高壓水動力注射的小鼠實驗模型近年來受到廣泛關注。HBV編碼質粒可作為一種cccDNA替代模板，由尾靜脈高壓水動力注射，通過體內轉染方式繞開潛在的病毒受體屏障，建立基於HBV編碼質粒的肝細胞內病毒複製。約4%~8%的小鼠肝細胞能夠通過這一途徑被有效轉染，同時，一過性表達的病毒抗原作為異己成分激活宿主免疫應答，在免疫機能正常小鼠模型中誘導類似急性病毒性肝炎的病理過程。值得注意的是，Huang等應用重組腺相關病毒（AAV）質粒載體攜帶HBV複製子，通過高壓水動力注射C57BL/6小鼠，超過40%的小鼠可檢測到持續的HBsAg抗原血症，病毒抗原的持續表達甚至超過一年，推測與重組AAV質粒載體特徵直接相關。高壓水動力注射簡便易行，HBV質粒系統和小鼠的遺傳學操作也易於實現，已經成為HBV研究中最為重要的體內實驗模型。

攜帶HBV複製子的DNA質粒可能具有與HBV cccDNA不同的病毒學特徵和宿主反應性。作者在研究中發現，與HBV複製子編碼質粒相比，rcccDNA能夠在高壓水動力注射小鼠模型中誘導延長的病毒抗原血症（5~7周），因此能夠作為一種基本策略發展HBV持續感染的小鼠模型。進一步，希望在模擬體內慢性肝炎的條件下分析cccDNA穩定性特徵。（1）通過引入shRNA敲低rcccDNA共轉染肝細胞表面的β2-微球蛋白，下調病毒感染細胞的MHC-Ⅰ類抗原遞呈；（2）通過敲除HBV X蛋白基因；（3）通過具有DNA結合能力的Cre-kox1融合蛋白，實現rcccDNA的表觀遺傳學沉默，誘導高壓水動力注射rcccDNA在小鼠模型中的持續表達（圖1）。但在HBV複製子編碼質粒中敲除HBV X蛋白，或共表達β2-微球蛋白基因特異的shRNA，並不能顯著延長小鼠模型中的病毒抗原血症，顯示HBV (r)cccDNA具有不同於普通質粒DNA的穩定性特徵。

圖1建立重組cccDNA持續表達和慢性感染的實驗小鼠模型a：應用shRNA敲低β2-微球蛋白，下調病毒感染細胞MHC-Ⅰ抗原遞呈；b:誘導重組cccDNA表觀遺傳學抑製；c:應用重組腺病毒載體投遞重組cccDNA; d~e:病毒載體投遞的重組cccDNA

誘導抗原持續表達和慢性肝炎

2.3 基於重組病毒載體轉導的小鼠模型

重組AAV載體由於其安全性好、宿主細胞範圍廣，被視為最有前途的基因治療載體之一。董小岩等和Dion等先後報導，應用高嗜肝性的重組AAV2 或AAV8載體經尾靜脈注射小鼠模型，能夠誘導HBV轉基因在小鼠肝臟中的持續性表達，注射5×1010病毒基因組12周後，仍檢測有60%的肝細胞為HBcAg陽性。由於持續感染和顯著的肝臟免疫耐受特徵（顯著增加的調節性T淋巴細胞和功能損傷的效應 T淋巴細胞），AAV-HBV小鼠模型被廣泛應用於抗病毒和主動免疫治療策略的評價。Lucifora等報導在AAV-HBV重組載體感染的小鼠肝臟中，應用 「金標準」Southern雜交方法檢測到HBV cccDNA形成，因此對「小鼠肝細胞中不能形成cccDNA」的普遍認識形成了挑戰；另一種假設則是，上述的cccDNA可能來自於與AAV-HBV細胞內中間體的重組產物，進一步設置HBV複製缺陷的對照實驗將有助於正確的認識。

慢性肝炎實際反映了機體不充分的抗病毒免疫效應，以及這一效應對肝組織持續的病理損傷。因此，如何在免疫機能正常小鼠中引入部分功能的抗病毒免疫機制，是發展慢性病毒性肝炎小鼠模型的關鍵科學問題。Protzer研究組應用重組腺病毒載體（Ad）攜帶HBV 基因組感染免疫機能正常的小鼠模型，儘管Ad具有顯著的免疫原性，在低劑量感染條件下仍誘導HBV持續性表達和功能耐受的病毒特異性T淋巴細胞應答。作者在最近的工作中，則利用Ad載體實現rcccDNA在小鼠肝臟的投遞。在1.5×109 PFU注射劑量下，重組Ad載體經由靜脈感染Alb-Cre轉基因小鼠大多數的肝細胞，通過位點特異性重組併產生rcccDNA，誘導持續高水準的HBV抗原血症；病毒持續感染誘導功能缺陷的T淋巴細胞應答，同時伴隨血清轉氨酶水準的升高，提示持續的肝細胞壞死性炎症；組織化學分析則進一步提示小鼠肝臟中纖維化形成。該研究將有助於對HBV持續感染和相關疾病過程的理解，同時也代表了一種重要的體內實驗模型系統進行抗病毒藥物篩選和評價。

3 總結

cccDNA是HBV慢性感染的分子基礎和重要治療靶點。在常用的體外模型中，PHH是天然的HBV宿主細胞，易於感染HBV，但其擴增性差，難以在體外維持分化狀態，而近期乾細胞領域的進展可能使其具有更為廣闊的應用前景。肝腫瘤細胞系是應用最為廣泛和有效的工具，能支持HBV複製和cccDNA形成，易於分子和細胞生物學的各種操作；過表達NTCP的HepG2細胞能夠支持病毒感染並從頭合成cccDNA，是近期HBV研究領域的一項重大突破。缺乏合適的實驗動物模型一直是HBV病毒學和免疫學研究的瓶頸。人肝嵌合小鼠模型能夠模擬自然感染，是目前最為有效的 cccDNA 體內實驗模型，然而由於技術操作複雜，可應用性較為局限；另一方面，免疫缺陷背景也是這一類模型的主要限制之一。DNA高壓水動力注射小鼠模型操作簡便，然而轉染效率較低、表達持續時間較短。小鼠肝臟中投遞rcccDNA代表了一種重要的體內實驗模型系統，可用於HBV持續性感染和宿主病理機制的研究。值得指出的是，rcccDNA策略為抗病毒藥物研究和高通量篩選提供了便利和高效的平台，因而獲得廣泛關注，先後建立了與羅氏、賽諾菲、強生等大型製藥公司和研發機構的合作研究。希望通過以上cccDNA實驗模型的介紹，能夠有助於加深研究者對HBV病毒學的理解。實際上，發展cccDNA模型系統本身也是對HBV病毒生物學特性的不斷探索，相信隨著科學的進一步發展，將會有更為理想的cccDNA模型系統問世，為人類最終攻克HBV奠定基礎。

引證本文：SU Y, ZHU YF, TIAN QY, et al. In vitro cell model and mouse model of HBV cccDNA[J]. J Clin Hepatol, 2019, 35(6): 1205-1211. （in Chinese)

蘇瑜, 朱園飛, 田青右, 等. HBV cccDNA的體外細胞模型和實驗小鼠模型[J]. 臨床肝膽病雜誌, 2019, 35(6): 1205-1211.