北京大學謝曉亮教授：單細胞基因組學迎戰新冠肺炎

2020年的開端，我們所有人都經歷了太多關於疫情的未知、病痛和恐慌。面對依然嚴峻複雜的疫情， 已正式上線。每周一期，全方位專業解讀病毒及流行病相關領域知識，深度分析謠言與真相，給你權威解答！

在4月2日的第四期直播中，我們邀請到了北京大學李兆基講席教授、北京未來基因診斷高精尖創新中心主任、北京大學生物醫學前沿創新中心主任謝曉亮為我們帶來《單細胞基因組學迎戰新冠肺炎》的主題分享。他向我們分享了作為後方的科學工作者是如何通過單細胞基因組學迎戰新冠肺炎的。以下是謝教授的演講內容整理。

特別鳴謝 稿件整理：

李敏，中科院生物物理所博士生

郭麗潔，中科院生物物理所博士生

謝曉亮：謝謝未來論壇的邀請，大家好！首先，我想借此機會，衷心感謝英雄的武漢人民，向一線的醫護工作者們致以崇高的敬意。我有兩個朋友也加入了援鄂醫療隊，我非常敬佩他們。

今晚的科普講座，我想跟大家分享的是，作為後方的科學工作者，我們如何通過單細胞基因組學迎戰新冠肺炎。

新冠肺炎席卷全球，控制疫情涉及四個方面：檢測、隔離、預防和治療。根據過去幾個月國內外疫情的發展，大家應該已經充分意識到了檢測和隔離的重要性，我今天的演講主要涉及預防和治療。

談到預防，人們紛紛把希望寄托在疫苗上。眼下全世界很多科學家正在研製疫苗，估計要年底才能出來。在疫苗出來之前，除了隔離，我們還能做什麽呢？世界急需的是強有效的治療方法，來降低死亡率，但是目前還沒有特效藥。

從上周中歐抗疫交流會上和前幾天的臨床結果，我們了解到，小分子藥物氯奎和羥氯奎在輕症患者上有一定效果，現在美國也開始使用了。小分子藥物，也就是化學合成藥物，一般研製周期很長，比如說十年。所以目前都是舊藥新用，藥效有限。

除小分子藥物外，血漿療法也初見成效。血漿療法就是把康復期病人的血漿離心，取上層清澈的血漿部分注射給病人。這是一種傳統療法，現在在美國等國家也開始使用。

血漿療法雖好，但有一定風險，因為血漿因人而異，是一個複雜的混合物；而且血漿來源有限，不可能大規模使用。

康復期病人的血漿中的關鍵成分是免疫系統產生的某種抗體。抗體是一種蛋白質，它的分子量是氫原子的15萬倍。所有抗體都有Y字形狀的結構，像兩把“鉗子”，用來捕捉抗原。那對我們來說，抗原就是新冠病毒。

新冠病毒是一種RNA 病毒，它的外殼上有刺突狀的S蛋白。S蛋白上面的紅色的部分是冠狀病毒的受體結合域（Receptor Binding Domain, RBD)。

新冠病毒入侵細胞時，S蛋白與人體細胞的表面受體ACE2結合，隨後病毒被內化，進入細胞，在細胞內被轉錄酶複製，重新組裝成大量新的病毒，又去繼續感染其他細胞。

抗體有很多種，我們關心的是中和抗體。中和的意思就像酸來了，我們用鹼來中和；病毒來了，細胞用抗體來中和。中和抗體的作用是牢牢地結合到病毒上，改變它的功能，阻止它侵入細胞。我們的目標是快速找到並製備高純度中和抗體，作為藥物，代替血漿給病人注射。

抗體藥物是一種大分子藥物，與小分子藥物相比，它的特異性好，副作用小，近年來有不少成功的例子。

艾滋病原來是不治之症，2018年以後美國FDA批準HIV的抗體藥物，與其他抗病毒逆轉錄的藥物聯合使用。

埃博拉病毒，三種單克隆抗體已獲美國FDA批準，目前正在臨床開發中。2015年，由軍事醫學科學院研發的抗體藥物MIL77成功治愈1名確診埃博拉病毒的感染者。

中東呼吸綜合征（MERS），2018年經過基因改造的牛生產的針對MERS病毒的人類抗體，在一期臨床試驗中表現良好。二期臨床因為疫情消失無法繼續。

以上這三種抗體藥物都是中和抗體。但問題是找到這些抗體的時間太長。採用的是單細胞克隆放大的方法，需要幾個月。我們現在就是要縮短這個時間。

我這裡順便提一下癌症。截止2018年，全球將近500個抗體新藥進入臨床試驗。它們不是中和抗體，而是與T細胞有關的抗體。其中以PD-1/PD-L1為靶點的抗體是研究熱點。

回到我們的課題：如何快速找到並製備高純度的中和抗體？

血漿中的抗體不計其數，種類約有10的7-8次方之多。想在血漿中直接找到新冠病毒的中和抗體，猶如大海撈針，目前無法實現。反正我不知道怎麽做。

我們需要走另外一個途徑，那就是先找到產生抗體的細胞。離心後血漿下面的這層是白細胞，其中包括人體內兩大免疫細胞，T細胞和B細胞。我們今天隻講B細胞。

B細胞是生產抗體的，它產生於骨髓，通過血液和淋巴液分布到全身的淋巴結。但是B細胞種類繁多，每個B細胞隻生產某一種特定的抗體；而這種抗體是由B細胞的DNA序列決定的。所以我們採用的辦法就是通過對B細胞進行RNA測序來找到我們想要的中和抗體。

我們尋找新冠病毒中和抗體之路開始於大年初三，曹雲龍在幾個月前剛從哈佛拿到博士學位，他是我的哈佛實驗室裡唯一一個跟我回國的。我們不是專門搞病毒或者免疫學的，單細胞基因組學是我們的專長。一開始我們只是想為抗疫做點事情，當意識到單細胞基因組學也許有可能幫助找到中和抗體的時候，我們非常興奮，立馬開始讀文獻，制定實驗方案，四處尋找儀器和試劑。北大和北京市各部門的同事十分給力，所以很快就萬事俱備。

2月2號，我和我們中心的蘇曉東教授，測序平台負責人耿晨陽去了佑安醫院。在這裡見到金院長和馮處長，他們當即就同意合作，要提供康復期病人的血樣。緊接著醫院的粟斌和郭向華研究員來到我們中心，完成單細胞測序技術的培訓後就回到醫院的P2+實驗室，類似於P3實驗室，所以他們要穿防護服等裝備。按理每天隻應該工作5個小時，但他們經常超時工作，還被隔離了整整兩個月。

在進一步解釋之前，我需要先給大家一些背景知識。

談到測序，大家知道這次疫情爆發後，中國科學家在一個月內就測出新冠病毒的完整序列，並在第一時間向全球公布，為新冠肺炎的檢測和研究奠定了基礎。相比之下03年SARS爆發時，最早的序列用了5個月的時間才測出來，是由加拿大的團隊最先公布的。

就在SARS發生的同一年，人類基因組計劃完成了，這是人類歷史上的一個里程碑。當時一家美國的私人公司和美國組織的國際團隊激烈競爭。私人隊的隊長Craig Venter測的是他自己的基因組。而美國領導的國際團隊耗資30億美金，測的是6、7個人的組合。

在人體細胞的細胞核裡有 46 條染色體，23 條來自於父親，23條來自於母親，染色體的主要成分是遺傳物質DNA。大家知道，二十世紀最偉大的生物學發現是 Waston 和 Crick的DNA雙螺旋結構。DNA有四種鹼基 A、T、C、G, A與 T 配對，C與G配對。簡單地說，鹼基排列的序列，像這裡，GTGACAG, 決定了遺傳信息，也就是基因。人類基因組有60億對鹼基，共有兩萬多個基因，對應兩萬多個蛋白質。人與人相比，絕大部分的鹼基都是相同的，只有千分之一鹼基序列的差別決定了我們之間的不同。比如說這裡，這一個人體細胞裡，來自父親和母親的DNA，他們的差別只是千分之一的鹼基。

按照分子生物學的中心法則，DNA攜帶的遺傳信息，即基因序列，用來在轉錄過程中由轉錄酶產生信使RNA，接著在翻譯過程中由核糖體生成蛋白質。蛋白質是以氨基酸為基本部門的生物大分子，一共有二十種氨基酸，它們手拉手得接起來形成鏈狀大分子，然後再折疊起來成為蛋白質，比如說Y字型的抗體蛋白。

蛋白質的合成遵循遺傳密碼。三個的DNA鹼基決定一個氨基酸。這裡是二十個氨基酸對應的鹼基序列。所以DNA的序列和蛋白質的序列有一一對應的關係。

其實轉錄和翻譯並不一定要在人體內進行，有了基因序列，我們可以利用轉錄酶和核糖體在體外生產抗體蛋白。

十七年過去了，生物基因檢測技術有了突飛猛進的發展。今天我就是想講怎麽利用最新技術解決當下的問題。

2007年發生了新一代DNA測序儀的革命，使得測序價格的下降速度比半導體工業的指數衰減還快。現在只要1000美元，在一天之內就可以完成個人基因組的測序。新一代測序儀使得個體化醫療成為可能。也就是說通過個人基因組的信息來了解病因，為治療和預防疾病提供個性化方案。

人類基因組和新一代測序儀之後的另一個革命是單細胞基因組學。也就是說你給我一個單個的人體細胞，我就可以告訴你它整個的基因組。這是怎麽實現的呢？現在還沒有一種技術可以把一個細胞裡的46根染色體每根從頭讀到尾，我們需要把單細胞裡的微量DNA擴增，然後用新一代測序儀來測序。

大家可能聽說過PCR，是30 多年前的一個DNA放大技術，對生物學、醫學有很大貢獻，得了諾獎。PCR非常靈敏，在犯罪現場有一個DNA分子，PCR就可以把它放大，測出信號。但是PCR有很大偏差，有些基因被放大的倍數很高，有些很低。用它來放大整個的基因組，覆蓋率只有5%。

2012年我的哈佛實驗室發明了一種單細胞擴增技術叫MALBAC。它的名字很像紅酒MALBEC。它大大提高了單細胞基因組擴增的均勻度、覆蓋率和測序的精準度。後來我們又發明了一個更精準的擴增方法叫LIANTI，也是一個紅酒的名字。

那我們為什麽要做單細胞測序呢？我給大家舉一個實際應用的例子。我們團隊和北醫三院的喬傑團隊、北京大學的湯富酬團隊合作，把這個技術用到生殖醫學。在試管嬰兒的過程中篩選沒有遺傳缺陷的受精卵，以避免父母的遺傳疾病遺傳到下一代。這是2014年在北醫三院誕生的首個“MALBAC嬰兒”，一個非常漂亮的女嬰。我們去看她的時候，一聲都沒哭，還一個勁衝我笑。迄今為止，在國內也有多於一千對夫婦成功地避免了單基因遺傳疾病的後代傳遞。

單細胞的測序不僅可以是基因組，而且可以是轉錄組，也就是所有被表達的信使RNA的序列。我們中心的湯富酬教授十年前在英國做博士後的時候，首次用新一代測序儀測出了單細胞的轉錄組。轉錄組很重要，因為它決定了細胞的功能。一般來講，不同種類的體細胞，它們的基因組都一樣，但轉錄組不同，因此功能不同。

這是我們最近和富酬等北大同事一起合作的數據。每個點代表一個單細胞，點的位置不一樣，因為它們的轉錄組不一樣，表達量不一樣。同一種細胞型的細胞會形成一個點簇，我們用不同顏色標記不同細胞種類。單細胞轉錄組已經被廣泛用於細胞分型。

我們現在就是用這種單細胞轉錄組的實驗給康復期病人血液中成千上萬的B細胞分型。我們先把單個B細胞從血液裡分離出來，然後測定每個細胞的轉錄組。同樣這裡每個點代表一個B細胞，不同的顏色代表不同的B細胞種類。

人們知道B細胞是由骨髓產生的，從造血幹細胞開始逐漸成熟，然後活化，最後變成漿細胞和記憶B細胞。這些不同的細胞種類我們都能看到。我們最關注的是記憶B細胞。

我剛說過，一般來講，在一個人身上，不同器官的細胞都有同樣的基因組和不同的轉錄組。但是B細胞在成熟過程中，它的基因組是可以被重組的。為了這個發現，日本科學家Tonegawa在1987年獲得了諾貝爾獎。在第14號染色體上，有V、D、J三個區域。V區域有40個相似但不同的DNA序列，D有23個，J有6個序列。

當B細胞從不成熟到成熟狀態轉變的過程中，基因組開始重組，就像從V、D、J三套牌各抽出一張。這樣轉錄和翻譯產生的抗體就有很多種。有多少種呢？40x23x6 =5520種，但這還不是全部。因為這個14號染色體只是合成重鏈（藍色），而輕鏈（白色）是由在第2號或22號染色體上產生的。它們有 V和J，但是沒有D。除了V(D)J重組，還有鹼基的隨機突變，都加在一起使得最後DNA序列的種類達到107-108種，為免疫系統提供了多樣性。

抗體是用Y字型結構上的兩把“鉗子”，來捕捉抗原。這鉗子嘴的形狀以及與抗原結合的強度，取決於它氨基酸的序列。這裡我要強調，我們特別需要單細胞的測序技術，因為每個B細胞通過V(D)J重組隻產生某個特定的抗體蛋白。

神奇的是，這107-108種產生不同抗體的B細胞，在抗原還沒有來的時候，已經在血液和淋巴液裡產生了。而當某一種抗原到來後，與它結合的抗體是怎麽被發現和富集的呢？

在B細胞在未成熟到成熟的過程中，這些抗體分子IgM被放在細胞的表面作為B細胞的受體。這些細胞一直不分裂，直到某個抗原，比如S蛋白，結合到BCR上，給這個B細胞一個信號，它就被激活了，開始縱橫諜海，一變二，二變四，這種B細胞就被富集了。

然後被富集的B細胞演化成漿細胞和記憶B細胞。漿細胞分泌IgG抗體到血液和淋巴結。而記憶B細胞留在骨髓和淋巴結很長一段時間。

因為記憶B細胞表面上有BCR也就是B細胞受體。我們可以用新冠抗原把記憶B細胞從康復期病人的血裡分離出來測序。

記憶B細胞的IgG抗體和漿細胞分泌的IgG抗體，接受同樣的抗原，因為它們兩對鉗子可變區的序列和結構都是一樣的，只是固定區的序列和結構不同–––在V(D)J區域後用的是不同的C區域序列。

讓我們看IgM和IgG抗體隨著時間的變化，第一次感染後，3天內出現IgM抗體，量不是太大，保留時間不長。

順便說一下，鍾南山院士的團隊的抗體檢測就是檢測IgM抗體。這方法很方便，隻用手指上取一滴血就可以了。但是感染後必須要等幾天才能知道。

我們想找的IgG一兩個星期以後才出來。持續3、4周，之後會減少。所以我們需要回訪的出院病人需要在這個時間段，如果康復時間太久了，IgG的量會越來越少。人類的免疫系統可以保證，如果第二次感染再發生的時候，免疫反應可以產生大量的IgG。

好，原理是這樣的，實驗怎麽樣？這是雲龍和文潔，孫文潔是我們中心的生物信息專家，他們拿到的一號病人數據。

這裡的六個記憶B細胞，它們的重鏈和輕鏈都有同樣的V(D)J序列，他們來自同一個母細胞，也有隨機的點突變。我們的假設是擁有同一種V(D)J序列的細胞數目越多，該細胞越有可能有好的免疫功能。這成為我們的第一篩選標準。這個選擇標準用傳統的單細胞克隆方法難以實現。因為我們有高通量的單細胞測序，就可以利用這個假設來高效得篩選。

另外我們拿到這個V(D)J序列，就可以在體外生產這個抗體。利用這個生物學的中心法則，我們可以交給一個公司來做。

用這種方法我們找到了一些與S蛋白有很強結合力的抗體，也找到了幾個中和抗體。但是這種方法的效率還是不夠高，因為抗體的種類還是太多了。

後來我以前哈佛的博士生張旭加入了我們。她把小磁珠跟S蛋白或RBD連接起來，用這塊磁鐵把能和S蛋白或RBD結合的記憶B細胞從血液中分離出來。這樣一來效率就大大提高了。

找到抗體後我們首先就測它的結合強度。抗體與S蛋白結合強弱是以結合常數來衡量的。左圖橫軸代表抗體在溶液中的濃度，豎軸代表與S蛋白的結合程度。抗體的濃度越高，結合程度就越高。當結合程度達到50%，抗體的濃度就是它與S蛋白的結合常數，這個抗體是40pM。這個數越低，表明結合強度越高。雖然聽起來抽象，但這40pM 對應每升血液裡只需要打入6毫克抗體，當然是越低越好。

中和抗體需與ACE2競爭。根據近來文獻報導，ACE2與S蛋白結合常數是35nM，如右圖，比抗體與S蛋白的結合常數高得多，所以結合強度低得多。

但我想強調，抗體結合力強不一定有中和能力，還要看結合的是不是S蛋白上關鍵部位。所以我們必須要做病毒的中和實驗。

鄭英慧是我們實驗室做中和實驗的能手。我們先做的是假病毒實驗，因為不需要P3實驗室。這個橫軸還是中和抗體的濃度。當抗體濃度特別高的時候，在細胞培養液裡的病毒與抗體結合，而不進入細胞，當抗體濃度低的時候可以看到它進去，病毒進入細胞通過熒光指示。當抑製強度達到50%的時候抗體的濃度被稱作半抑製濃度，對於這個抗體我們當時看到的是50pM，0.008微克/毫升，假病毒實驗成功後，下一步就是到P3實驗室看真病毒被抗體抑製的情況。

這是最近從P3實驗室得到的體外實驗數據，讓我們非常高興。這3個抗體的半抑製濃度都小於1μg/mL(1-10nM)。這個實驗主要是看細胞的死亡。左圖中，抗體濃度較低時，細胞受感染而凋亡。右圖中，在中和高抗體濃度的時候，病毒感染被有效抑製。

總結一下，我們已經從70個康復期病人血漿裡的三十萬個B細胞中，篩選出300個富集度最高的IgG抗體序列。

根據這些序列已經生產出300個抗體蛋白，正在測試，目前已篩出一大批高結合強度的抗體（kD=10 pM-10nM）和多個有出色中和活性的抗體。

高通量單細胞轉錄組和V(D)J測序，可直接檢測B細胞的富集程度，使得我們可以快速精準地篩選出大量優質的中和抗體。

後續的動物實驗已在籌劃中，臨床實驗是下一步。

篩選出的中和抗體有兩個應用。一是可以用於新冠肺炎的中和抗體治療，更安全且針對性強。

二是用於短期預防，保護我們的醫護人員和病人家屬，有效期大概3周，經過抗體改造有可能延長至3個月。

國內另外幾個團隊也一直在尋找中和抗體。我們的目標都是一致的，希望找到最好的抗體，盡早成藥！

我們的工作為將來可能出現的疫情做好了準備。用我們的新方法，對病毒有良好中和活性的抗體應該在十天之內就可以找到。

最後我想說，去年八月，在中美貿易戰, 以及我與美國科學家的合作受阻的背景下，我在Cell雜誌發表了這篇文章《Disease Has No Borders, Neither Should Research》。果然如此，這次疫情使人們自覺或不自覺地認識到，病毒沒有國界，抗疫也應如此！目前中國住院的病人已經越來越少，我們的臨床試驗也將要在疫情更為嚴峻的地方來進行。如果成藥，我們不會命名它為“中國抗體”，因為它的使用應該是沒有國界的。

今晚我之所以能在這裡跟大家分享，是因為我身邊這些並肩作戰的夥伴，我的團隊，還有合作者，很多都是疫情之後認識的。我也非常感謝北京市政府、北京市教委的大力支持和北京市科委的協調推動！

這是我們的中心。北京大學生物醫學前沿創新中心是一個以技術驅動為核心的多學科交叉的生命科學研究中心。北京未來基因診斷高精尖創新中心於2016年在北京市教委的支持下成立，專注於基因技術研發及其醫學應用。中心許多同事最近也都投身到有關抗疫的研究中，利用自己的專長，為控制疫情貢獻力量。

最後我也想對年輕的朋友們說幾句話。未來論壇一直倡導年輕人熱愛科學、投身科學。科學的重要性通過這次疫情得到了最好的體現。兩個月來，我和我的團隊與世界上許許多多科學工作者夜以繼日、爭分奪秒地工作。這是因為我們堅信，科學一定可以戰勝病毒，使人類免於災難。而疫情在各國的發展軌跡也證明，政治家的決策是否得當，在相當程度上取決於他對科學的了解，和對科學的尊重！

我的講座就到這裡，謝謝大家！

Q & A

直播間觀眾提問與解答

Q1：患者康復後複陽是什麽原因？是否存在不產生抗體的人群？

A：人的免疫系統因人而異，一般來講年紀大的人免疫系統會有些退化，這也是為什麽年紀大的新冠肺炎患者更容易轉重症。剛才談到記憶B細胞，按道理講記憶B細胞會回到骨髓裡面，二次感染後它可以馬上大量增殖。實話說我不是這方面的專家，我覺得複陽是由於免疫功能不完善，也就是記憶B細胞產生的IgG抗體不夠多。這裡也有很多未知的因素，我認為主要是人類免疫功能的不完善所導致的。

Q2：您和您的團隊對本次疫情持續的時間是如何預測的？請問從尋找中和抗體到藥物正式投入使用的周期有多長？對於治療此次新冠病毒是否來得及？

A：有人預測疫情蔓延到南半球，然後又回到北半球。也有人預測夏天消失，冬天會再來。我也不知道疫情究竟會如何發展。但如果病毒十月份再回來，那時候我們的中和抗體可能已經研製成功了。我認為距離實際使用大概還需要幾個月。

Q3：近期聽說使用恢復期血漿治療有效？也有人說還存在促進炎症風暴的風險，請問中和抗體存在類似風險嗎？

A：這是一個很好的問題。我剛才講的是中和抗體的優點。它的特異性好，相對小分子藥物來講，研發的時間短。那有沒有什麽副作用呢？我不確定它是否和炎症風暴有關，不過已知的副作用是抗體依賴增強作用（ADE）：抗體進入人體是要中和病毒的，但是有的時候它會結合病毒後把病毒拉入人體細胞。當然這個ADE是要盡量避免的。但好消息是ADE還是比較罕見的，而且這個現象與抗體有關，我們可以從多種抗體中篩選出一個不產生ADE現象的。

Q4：請問中和抗體藥物製造是否成本很高？是針對危重病人還是所有病人都用得上？

A：一般來講，大分子藥物要比小分子藥物貴。但小分子藥物每天都得吃，而抗體藥物可能隻用打一針。我們希望做的藥也是打一針就見好。不過像HIV那個抗體藥過一陣就得打一針，確實比較貴。我們現在就想先把藥做出來，價格我也不清楚。

Q5：第五個問題，中和抗體藥物用來預防能持續多久？進入體內抗體多久會消失？

A：我剛才說藥效大概三個星期，但是它的半衰期是可以控制的。最近有很多工作，把病毒的恆定區的序列改變後，可以延長抗體的壽命，所以說抗體藥效持續三個月是有可能的。但它畢竟和疫苗不一樣，中和抗體的預防藥效不會是永久的。