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Science:湯富酬研究組與合作者揭示人類結直腸癌發病新機制

2018 年 11 月 30 日,北京大學北大 - 清華生命科學聯合中心(CLS)、北京未來基因診斷高精尖創新中心(ICG)湯富酬研究組,與北醫三院付衛研究組、喬傑研究組,在《Science》期刊發表了題為 「Single-cell Multi-omics Sequencing and Analyses of Human Colorectal Cancer」 的研究論文。該研究在國際上首次從單細胞解析度、多組學水準深入解析了人類結直腸癌在發生和轉移過程中,基因組拷貝數變異、DNA 甲基化異常及基因表達改變的特點及相互關係。

結直腸癌是發病率和死亡率很高的一種癌症。基因組不穩定性、表觀遺傳學異常及基因表達紊亂等是結直腸癌典型的分子特徵。腫瘤組織具有很強的異質性,以往在大量細胞水準的研究只能反映腫瘤組織的系綜平均情況,而無法精準區分不同的腫瘤亞克隆以及腫瘤微環境中的其他細胞類型。一般的單細胞單組學測序技術只能分別研究單細胞基因組、單細胞 DNA 甲基化組、或者單細胞轉錄組,不能做到在一個單細胞中同時平行分析多個組學層面。湯富酬研究組對該課題組已發表的 scTrio-seq(single-cell triple omics sequencing technique)技術進行了大幅度的優化,極大地提升了對單個細胞轉錄組的檢測效率和 DNA 甲基化位點(CpG 位點)的覆蓋度,達到與利用完整單細胞進行高精度轉錄組分析、或者利用完整單細胞進行高精度 DNA 甲基化組分析相近的效果。在 HEp-2 細胞系中,單個完整細胞的高精度轉錄組測序平均可以檢測到 9,158 個基因的表達,而 scTrio-seq2 的轉錄組部分平均可以檢測到 8,106(88%)個基因的表達;DNA 甲基化組方面,scTrio-seq2 的 DNA 甲基化組部分和單個完整細胞的高精度 DNA 甲基化組測序(scBS-seq)均可以檢測到 1600 多萬個 CpG 位點。該研究對患有結直腸癌並伴隨轉移的 12 例患者的原發位、淋巴結轉移位、肝轉移位等樣品進行了多點取樣,對 1,800 多個細胞進行了高精度的單細胞多組學測序(scTrio-seq2),共產生了 7.6 Tb 高品質的測序數據。scTrio-seq2 的 DNA 甲基化組部分,平均每個細胞的測序量為 4.1 Gb,平均覆蓋到全基因組範圍的 870 多萬個 CpG 位點;scTrio-seq2 的轉錄組部分,平均每個細胞測序量為 0.9 Gb,平均可覆蓋到 3700 多個基因。

該研究的主要發現有:

(1)基於 DNA 甲基化組數據推斷出的基因組拷貝數變異精準鑒定了腫瘤細胞的亞克隆。該研究精準鑒定出了結直腸癌患者單個癌細胞的染色體拷貝數變異譜,並利用其高精度的染色體內斷點資訊進行了腫瘤細胞的譜系追蹤。對於其中 5 例患者,在每個患者腫瘤組織中鑒定出了多個(6-13 個)腫瘤細胞亞克隆,發現原發位腫瘤的亞克隆結構通常比轉移位腫瘤更複雜。

(2)系統解析了腫瘤細胞的 DNA 甲基化異質性。在全基因組水準,檢測到腫瘤細胞的 DNA 甲基化水準普遍低於癌旁的正常上皮細胞,而且 DNA 甲基化降低的程度存在很大的異質性。與癌旁的正常上皮細胞相比,單個腫瘤細胞全基因組 DNA 甲基化水準可降低 7-36%。腫瘤細胞特異性 DNA 低甲基化基因組區域顯著富集在 LTR、LINE 等基因組重複序列和異染色質區域,而腫瘤細胞特異性 DNA 高甲基化的基因組區域顯著富集在 CpG 島和常染色質區域。

(3)闡明了 DNA 甲基化譜和遺傳譜系的相互關係。利用鑒定出的腫瘤細胞遺傳譜系資訊,發現腫瘤細胞的基因組 DNA 甲基化譜與遺傳譜系高度一致,同一塊腫瘤組織中同一譜系的腫瘤細胞 DNA 甲基化水準高度相似,而不同譜系的腫瘤細胞 DNA 甲基化水準可存在很大差異。所以腫瘤組織基因組 DNA 甲基化的強烈異質性主要來自同一個患者腫瘤內不同亞克隆之間的 DNA 甲基化差異,而不是同一個亞克隆內部不同細胞間的 DNA 甲基化差異。

(4)闡釋了 DNA 甲基化譜和基因表達譜的相互關係。在單細胞水準,基因啟動子區域的 DNA 甲基化與相應基因的表達呈現強烈的負相關關係,而基因區的 DNA 甲基化與相應基因的表達呈現正相關關係。對於測序單細胞數量較多的 4 例結直腸癌患者,其中 1 例患者腫瘤細胞的轉錄組亞群、遺傳亞群(亞克隆)、和 DNA 甲基化亞群三者之間呈現出一一對應關係;而在另外 3 例患者中,轉錄組亞群、遺傳亞群(亞克隆)、以及 DNA 甲基化亞群三者之間的關係較為複雜,沒有簡單的一一對應關係。

(5)首次在單細胞解析度追蹤了同一遺傳譜系的腫瘤細胞在轉移過程中 DNA 甲基化及基因表達的變化情況。對於同一個癌症患者同一遺傳譜系的腫瘤細胞在從原發灶到轉移灶的轉移過程中其全基因組 DNA 甲基化水準相對穩定,而基因組局部區域的 DNA 甲基化水準可能發生較大變化。上皮 - 間充質轉化相關的重要基因在轉移前後的腫瘤細胞中其 RNA 表達水準和 DNA 甲基化水準均沒有發生顯著改變。

(6)揭示了結直腸癌細胞 DNA 去甲基化的共同特點。在全部進行了單細胞基因組 DNA 甲基化測序的 10 個患者中,腫瘤細胞的 DNA 去甲基化程度與相應基因組區域在癌旁正常上皮細胞中的 DNA 甲基化水準呈現正相關關係,也就是說,在正常上皮細胞中 DNA 甲基化越高的基因組區域,其 DNA 去甲基化越強烈(DNA 甲基化降低的絕對值和降低的相對比例都更大)。DNA 去甲基化的程度與基因組重複序列 L1 以及癌旁正常組織中 H3K9me3 標記的異染色質區域的分布密度呈現強烈的正相關關係,而與開放的染色質區域以及 H3K4me3 標記的基因組區域呈現強烈的負相關關係。與正常的早期胚胎髮育過程中的兩次大規模基因組 DNA 去甲基化相反,相比於 L2 基因組重複序列,進化上更為年輕、更為活躍的 L1 基因組重複序列經歷了更強烈的 DNA 去甲基化。


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