腫瘤研究可重複率奇低，究竟誰之過？

圖片來源：斯坦福大學醫學院，圖片為編者加

撰文 | 文海軍，王巨集毅，賀雄雷，吳仲義翻譯 | 何東明責編 | 蔣海宇

早前有研究指出，近九成腫瘤生物學論文的實驗結果不能重複。最近，eLife期刊上刊登了五個詳細的重複性研究，將這一數字證實。研究結果的不可重複常被歸咎於人為因素，因而認為可以避免。但是其原因也可能是生物學上的，以致這些研究本質上就無法重複。腫瘤研究的可重複率低，將深刻地影響到臨床的方案，同時也反映出腫瘤生成多樣的進化通路。

背景

可重複性是實驗科學的基礎。儘管多種因素困擾著不同研究領域，影響的程度也不盡相同，腫瘤研究卻顯得首當其衝。早前一個報告指出，53個發表的腫瘤研究，只有6個的結論可被重複。可重複率低至10%，讓人擔憂。該報告同時還指出，極低的可重複率也是製藥工業界的普遍經驗。

這麽低的重複率引起了特別關注。因為那些成果一般都發在高影響因子雜誌上，所以它們對腫瘤的臨床與基礎研究正有著實質的影響。通過這篇評論，我們首先回顧對研究結果可重複性的最新評估。第二，我們將探討造成這低重複率的根本原因。儘管低重複率常被歸咎於人為因素，但實際上是有更深層生物學原因的。第三，哪些研究應該能重複，哪些研究本質上就不可重複，我們應做一個明確的劃分。第四，我們為如何應對結果不可重複提出了一些建議。

可重複性評估的最新消息：腫瘤重複性研究項目

腫瘤重複性研究項目（RP：CB）是為了嚴格地解決可重複性這個問題而發起的。它選了高影響因子期刊上 30個腫瘤研究進行可重複性研究。因為不能重複大都是由於技術因素，該項目的重要貢獻之一就是排除了這些明顯原因的可能性。正式重複研究之前的注冊報告會概述重複實驗的設計。實驗設計被審議並通過後，重複性研究才開始進行。因為雙方都同意可重複性原則，所以重點放在確保實驗材料與方法被準確複製。

第一批研究報告已經發表。可重複性在報告裡指“治療方案的可操作性與可重複性”，因為這些原論文都包含了一個治療方案。按eLife編輯部的說法，其中兩個研究“可重複重要部分”，一個“不可以重複”，余下兩個“難以判讀”。另一個新聞報告把整體結果描述成“混亂如泥”。我們認為這些判讀過於謹慎了，從更為常規的角度看，五個研究中有四個都該被判為“不可重複”，一個“難以判讀”（如下表所示）。

我們就從eLife編輯部認為難以判讀的兩個報告說起。兩個實驗被定為難以判讀是因為其對照組的不可重複。對照組不能被重複與實驗本身不能被重複其實並無大異，我們因此把這兩個研究判定為“不可重複”。在Berger等人的論文中，PREX2基因在人黑色素瘤中普遍發生了突變（107個中有15個）。進一步地，引入了PREX2突變的人黑色素細胞進行的異體成瘤實驗發現，實驗小鼠的無瘤生存期顯著縮短。Horrigan等人在重複性研究中，引用了近期的研究。這些研究並不支持人黑色素瘤中普遍發生了PREX2基因突變這個說法。並且，Horrigan等人不能證實PREX2突變能降低無瘤生存率，因為沒有突變的對照組的死亡速度也是一樣快（1周）。這與原論文中公布的9周中位生存期結果相反。

在另一個研究中，Willingham等人指出，CD47蛋白在多數癌症細胞膜是過表達的。由於CD47信號通路會阻止巨噬細胞對癌細胞的攻擊，因此阻斷CD47通路，可使經注射了MT1A2癌細胞的免疫活性小鼠中原位乳腺腫瘤的大小比對照組減少約10倍。而在Horrigan等人的重複研究中，腫瘤的大小離奇地在CD47處理組與IgG處理的對照組中逆轉過來了。Horrigan指出，腫瘤的大小是高度可變的。通常，在同一種處理條件下可有5倍的差異變化。在腫瘤進化中，這種高度的可變性也很普遍，但常常被視為噪音了。應該指出的是，Willingham等人通過將人腫瘤細胞移植到免疫缺陷小鼠中也獲得了類似的結果。Horrigan報告說，異種移植實驗僅在一些後續研究中得到了重複。

報告中被判為一定不可重複的，是Sugahara等人的研究。他們發現用iRGD多肽處理腫瘤可使腫瘤細胞對藥物的通透性增加。在他們的研究中，腫瘤是由異體移植的前列腺癌細胞所生成。Mantis等人不能重復出該結果，但過去別的研究報告認為這結果是可重複的。所以 Sugahara等人的工作雖然 eLife無法重複，但這工作並沒有特別不可靠之處。

對於其余兩項宣稱“本質上可重複”的研究，有一項在大多數情況下是不會被認為是可重複的。Sirota等人的在細胞系上進行藥物研發的生物資訊學分析發現，西咪替丁可作為抗肺腺癌細胞的有效分子。雖然相同的趨勢在Kandela等人的重複研究也能看到，但與對照組的差異並不顯著。如Dang所說，其原因是Sirota等人報導的西咪替丁的作用太弱，而不具有生物學意義上的顯著性。總體而言，與平均值的小差異相比，以這樣的組內差異很難得出西咪替丁可成為治療肺癌的有效新藥。

5項研究中唯一可重複的是Delmore等人的研究。 在原研究中，他們報導小分子（+）- JQ1通過下調MYC的轉錄並減少多發性骨髓瘤的大小，從而改善異種移植小鼠的存活情況。 雖然Aird等人成功重復出了該結果（有一些變化），但使用不影響MYC轉錄的對映異構體（-）- JQ1的陰性對照組得到了與（+） - JQ1相同的生物學效應。鑒於陰性對照也會產生相同的效應，我們建議將原研究定為難以判讀。

不能重複的原因

五次重複實驗證實了先前報告中6/53的重複率。以前的報導暗示了是技術（甚至倫理）失誤是導致低重複率的原因；然而，它們所提及的因素在整個生物學科中都很常見。而且，人們對RP：CB的悉心投入，也說明在重複性研究的努力應是充分的。因此，下面我們來尋求生物學的解釋。

實驗研究能否重複，取決於複製實驗的測量結果能否符合原實驗。 投擲硬幣時，連續五次看到同一面的重複率不會高於10％。 在癌症生物學中，重複性意味著腫瘤發展過程對應於高度受限的過程，類似於組織的發育。但是，如果腫瘤發展循著進化的路徑，那麽結果就可能變化很大。進化過程往往包含多個步驟，需要一系列的遺傳變化。而這些變化又都由隨機因素控制，包括突變的出現，隨機漂變和不同選擇壓力。由於每一步又都受前一步的影響，因此早期的小偏差也可能產生迥異的結果。

S. J. Gould在他的《奇妙的生命》一書中提出了進化本身的再現性問題。他好奇如果我們回卷“生命的磁帶”，進化是否會遵循相同的軌跡重新展開（另見康威?莫裡斯）。“將生命磁帶卷回”到寒武紀大爆發當然只是幻想，但不斷重複的進化過程確實存在，最好的例子可能就是癌症的進化了。因此RP: CB的注冊/複製報告，以及編輯意見和評論中都沒出現“進化”一詞，實在讓人摸不著頭腦。

可重複的進化過程等同於趨同進化。在趨同進化中，生物重複地“選擇”了一條有主導優勢的進化路徑。在趨同進化的範疇中，表型與基因型的區別尤為重要。自然界中，表型趨同是常見的。表型的趨同也是病理學家定義腫瘤惡性的基礎。然而關鍵問題是：構成表型基礎的基因型是否也有那樣的趨同性呢？腫瘤生物發表論文中對體細胞突變、基因表達、靶向治療不斷引證，顯然是認為基因型也有趨同性。

在這種背景下，大型研究項目TCGA（美國癌症基因體圖譜計劃）曾試圖尋找腫瘤中經常突變的基因。結果是，腫瘤細胞的基因型趨同性比所希望的要低得多。比如說，12種癌症中，只有兩個基因（TP53和PIK3CA）在超 10%的案例中發生突變。TP53是人基因組上的一個特殊分子，而PIK3CA 基因很長。對一特定癌症而言，腫瘤共有的高突變（在多於10%的情形中突變）的基因數一般只有10個左右。在如此低的基因趨同性下，二個同樣類型的癌症往往只有少數的突變基因相同，甚至是一個沒有。這些觀察說明，即使開始條件相近，腫瘤也會循著不同進化軌跡發展。即使是從同一個起點（來自同一個人）開始的癌細胞，也會進入不同進化軌跡，產生豐富的基因多樣性，因而對同一治療產生不同響應。

TCGA項目反映出來的現象在自然群體中是同樣存在的。儘管可觀察到像回聲定位基因這樣的特別的基因趨同現象，但這很少見。對於並不涉及到有高度特化結構的生物，生物分子的多樣性機制依然起效，於是基因型趨同將不會發生。例如，對高緯度的西藏，埃塞俄比亞，安第斯高原的居民來說，他們在高原環境的低氧適應性方面的基因突變是不同的。最近，為了尋找這一現象的分子趨同機制的大型基因組測序分析發現，這些相關的突變遍布了人的整個基因組。這再一次說明，即使在相同的環境下的多個基因組，分子趨同性還是不常見的，而其涉及的信號甚至很少超過實驗結果的背景噪音。

儘管如此，癌症發展和生物體趨同進化是可以觀察到的，只是條件非常嚴格：必須得有一個決定性的進化途徑來介導最後結果的產生。比如，當實驗生物體的基因非常簡單（比如病毒），那麽基因進化的可選擇方式就只有少數幾種。或者，當對特定遺傳變化的選擇壓力很強時，則可能會出現分子趨同的結果。為此，Wu等人推測，“液體腫瘤”裡，選擇壓力就可能特別高，因為具有增殖優勢的細胞在裡面可以迅速而廣泛地擴散。確實，慢性粒細胞白血病，以其特徵性BCR-ABL異位融合作為一個診斷標準，就是腫瘤在基因水準上進化趨同的一個最好例子。總的來說，當充分考慮了腫瘤進化的表型多樣性與基因多樣性的本質，以及哺乳動物基因組的複雜性的時候，我們可以推斷出腫瘤發展過程的分子趨同性是個例，而非普適原則。

誠如TCGA所揭示的，真實情況下腫瘤發生分子趨同的可能性很低。但人們依舊期望，當大部分的實驗條件受到控制時，他們能在小鼠身上發現高程度的趨同現象。如今，即使在簡單的模型裡，RP:CB項目也證實了進化的不可預測性。在5個RP:CB報告中，來自癌細胞系的細胞被移植到小鼠身上，或是自體或是異體移植。接著，實驗組（E）與對照組（C）的樣品被收集，作為原論文的E1,C1與重複研究的E2,C2。每隻小鼠的腫瘤的生長是兩個進化過程累積的結果。第一個是在移植前，待移植的癌細胞群體已經發生了差異性的進化。第二個是在移植後，癌細胞繼續發生異質性的改變。移植後的變化經常在分析中被提到的，但移植前的變化卻往往被忽略，即使進化不斷。腫瘤細胞這一階段的變化讓人聯想起經典的“盧裡亞/德爾布呂克波動”。

由E1，C1，與E2，C2兩次研究所得到的結果都是條件分布的。RP:CB的最終分析依據對（E1,C1）和（E2,C2）的比較。在那些不能重復出原結果的研究中，C1和C2在二項研究（PRX2, CD47）的實驗裡沒有經歷相同的進化過程， E1和E2在一項研究（iRGD）中趨異進化（參考表1）。在另一項研究（cimetidine）中，E1和C1的差別太小而沒有生物學或統計學意義上的顯著性。

RP:CB報告的腫瘤進化過程可用下圖這樣一個簡單遺傳模型勾畫出來，它將進化途徑定義為服從條件概率。這裡，通過從已有的多樣性裡獨立出來或是出現新的基因突變，進化每一步都受著前一步的影響。因此前一步的微小變化都可能會帶來之後的更大差異。在圖1的階段2中，兩個重複實驗的軌跡幾乎沒有重疊，因此出現了非常不同的腫瘤表型。如果採用比圖1更真實的模型來分析，所得到的腫瘤將很可能屬於不同模式。我們因此建議，腫瘤研究需要發展出明確的腫瘤進化模型，而不能假定結果是簡單和可重複的。

圖1

哪些研究能重複，哪些不能？

RP:CP項目在一定程度上揭示出了什麽研究是可能重複的，什麽是不可能重複的。如果所分析的表型在實驗過程中不發生進化，那麽重現性通常很高。例如化合物JQ1處理後使得MYC轉錄下調的結果是可以重復出來的。同樣的，Horrigan所進行的重複實驗也觀察到使正常小鼠出現輕度貧血的毒性作用：該實驗中，小鼠的組織是未發生進化的。

在腫瘤的進化中，可重複性將是一個關於進化途徑的數量，強度和長度的函數。TCGA的數據表明，腫瘤進化所涉及的路徑數目一定相當大。而隨著每一路徑上的步驟數目增多，不同可能性的量就將呈指數增長。這就使得許多腫瘤研究結果不能被重複。我們還應注意到，圖1中對隨附性（contingent）進化的描畫，將因樣本數量的增加而變得非常困難。

面對進化路徑的多樣性，腫瘤生物學研究往往試圖分離出共有部分路徑的病例：比如共有EGFR基因突變的肺癌。這些病例確實對EGFR抑製劑顯示出穩健及比較可重複的結果。但這些被部分劃定的遺傳途徑仍然常常是多樣的，也常常產生不可重複的結果，如腫瘤耐藥性。

結 論

讓人奇怪的是，幾乎沒人對RP:CB和之前的其他重複性研究做出討論。也許根據主流觀點，既然低重複率是人為因素造成的，那就無須進一步的深入探討了。但這個缺乏證據的說法，可能掩蓋了低重複率背後更根本的原因。從進化的角度來看，很多研究固有地無法重複，是因癌變通常不沿著同一進化路徑發展。

目前，可重複性仍然是腫瘤生物學研究的核心原則。該原則假設了腫瘤的趨同進化，並認為腫瘤在其中會經歷相對明確的遺傳變化。於是，在基礎研究中，我們發現了遺傳上的一些改變，然後就研發靶向這些改變的治療策略（即靶向治療）。然而，基礎遺傳結構的持續演變使得突變成為了“移動的目標”，無論是在個體之間還是個體內部。從這個角度上講，基因靶向治療違背了進化的原則。

不進化或緩慢演化的性狀可能是更好的目標。耐藥性的演變確實也仍是癌症靶向治療的主要障礙。主要的3種單克隆抗體藥物貝伐單抗，曲妥珠單抗和利妥昔單抗的療效具有指導意義。貝伐單抗和曲妥珠單抗分別靶向VEGF和HER-2，然而療效有限。相反，利妥昔單抗是靶向在pre-B細胞表面都表達的CD20，能顯著提高B細胞淋巴瘤患者的生存期。這也許是因為它不以細胞進化的產物作為靶點。近期的靶向基礎轉錄裝置的治療策略，與這種支持以非變動分子作為靶標的看法是相一致的。

最後，儘管許多疾病從達爾文式醫學的角度來看，都是進化的產物或副產物，但腫瘤的發生是不同的，因為它並不僅僅是進化的產物：它就是進化過程本身，或者說是進化正在進行的表現。Lewontin指出，進化的精髓就是其多樣性。值得探討的正是這種多樣性，而非某個標準型。對於腫瘤研究，進化路徑的多樣性也有顯著的臨床意義。H. J. Muller在《物種起源》出版一百周年時，評論說生物學已經很長時間沒有進化思維了。如今五十年又過去了，Muller的評論對腫瘤研究依舊不顯過時。

版權聲明：

英文原文2018年2月發表於《國家科學評論》（National Science Review, NSR），原標題為“On the low reproducibility of cancer studies?”。NSR是科學出版社旗下期刊，與牛津大學出版社聯合出版。《知識分子》獲NSR和牛津大學出版社授權刊發該文中文翻譯。