握住“上帝的手術刀”

【老冀曰】

CRISPR 基因編輯是目前最紅火的生物科學技術，對人類的疾病研究有重要的意義，因而被稱作“上帝的手術刀”。2018年12月下旬，愛博物（北京）文化科技有限公司組織了16名中小學生前往位於青島黃島的國家海洋基因庫，親手進行了斑馬魚的CRISPR基因編輯實驗，為孩子們揭開了基因科學的神秘面紗。

握住“上帝的手術刀”

愛博物CRISPR/Cas9編輯課程感悟

冀子驁/文

2018年12月下旬，我參加了由愛博物組織的基因編輯學習項目。這也是我第二次近距離地接觸生命科學。2018年9月，我曾經參觀過由華大基因運營的中國國家基因庫，並對生命科學有了基本的了解。這次，我又來到了位於青島黃島的國家海洋基因庫，親手進行了斑馬魚的基因編輯實驗。這個活動不僅教會了我更多有關生命科學的理論知識，也揭開了我心中操作基因編輯技術的面紗。

在這次活動中，我們學習了在生命科學領域被炒得沸沸揚揚的CRISPR/Cas9基因編輯技術。而實驗目標則是對斑馬魚胚胎進行CRISPR 基因編輯，實現對斑馬魚flh基因的敲除。flh是斑馬魚基因中控制脊索發育的基因。如果實驗成功，我們應該能夠觀察到斑馬魚胚胎的脊索比野生型更短小且彎曲。

得益於國家海洋基因庫的定位和地理位置，斑馬魚在這裡是實驗常用的模式生物。模式生物是指那些用於揭示某種具有普遍規律的生命現象的一類生物。斑馬魚和人類的基因有87%同源，其中很多的致病機理都是相同的。並且它的性成熟周期短，產卵量大，容易飼養。因此斑馬魚是國家基因庫生物科學實驗的重要載體，在國家海洋基因庫中就能看到大批量的自動化養魚缸。

在第二天剛剛對生命科學有了初步的了解之後，我們就進行了本次活動的第一個實驗——解剖尾複蝦虎。在實驗課上，老師甚至開玩笑提起“清華北大欠釣魚人一張文憑”的調侃。

在真正動手操作以後，我也體會到了要想完美地展現出魚內部的身體構造絕非易事。對於從來沒有在家中做過魚的我來說，我對魚肉的質感和厚度完全沒有概念，對魚的腥味也很是不習慣。根據老師的指導，我從肛門處沿著魚的側線將魚的肚子剖開，卻看不見任何內髒器官，通過不斷地調整剪刀的角度和剪切的力度，終於將魚的腹部完全剖開。後來發現，由於過於小心謹慎，我並沒有將剪刀插入肌肉的內部。這也就證明了沒有經過大量訓練，是不可能很熟練而順利地進行實驗操作的。

首次的實驗的不順利並沒有打消我對後面的CRISPR 基因編輯斑馬魚實際操作的信心，反而激發了我的好奇心。在後續的課程中，我逐漸了解到分子生物學實驗室所用的儀器和材料，與學校中的化學實驗室本質上沒有什麽區別。但是，在國家海洋基因庫的實驗室中，儀器要更加齊全、精密。

以我們在為期一周的實驗中幾乎每天都會使用到的移液槍為例，移液槍實際上叫做微量移液器，相當於普通化學實驗室中的膠頭滴管，只不過它的量程和精度值都更小，是以微升為部門計量的。也正因為這個原因，移液槍使用起來要比膠頭滴管難很多，我就因為操作失誤而添加了過多的材料到配製容器中。

在了解了各種各樣的生命科學的精密儀器之後，我們就開始了分子生物學以及CRISPR 技術的學習，也對高大上的 CRISPR/Cas9有了初步了解。

CRISPR/Cas9 早在1997年就在大腸杆菌中被發現。科學家根據其中存儲著的噬菌體RNA推測，它是細菌用來對付天敵噬菌體的獲得性免疫系統。當噬菌體向細菌細胞內注入致命的RNA時，細菌內的Cas9蛋白就會在 CRISPR 系統中引導RNA（sgRNA）的指引下鎖定噬菌體RNA。而Cas9蛋白就會負責剪斷噬菌體RNA，使之失去活性。

然而，直到五年前 CRISPR/Cas9 系統才成功地被科學家用來在哺乳動物內進行基因編輯。人類將 Cas9 蛋白化為己用，將噬菌體 RNA 替換為了我們的目標序列。這種使人類有能力改寫生命的技術也被形象地稱為“上帝的手術刀”。

在這次活動中，我們也親手配製並操控了這把“上帝的手術刀”。

首先，我們著手進行引導 RNA 的設計並在實驗室中進行合成。在進行了這些實驗之後，我才直觀地感受到分子生物學實驗實際上不如我們想象的那麽直觀。

和大部分的化學實驗是一樣的，分子生物學實驗是在分子的微觀層面進行的，而通過肉眼我們只能觀察到把一堆原材料都兌到了一起，有時候甚至都沒有顏色、形態上的變化。尤其將 DNA 模板經過 RNA 合成酶進行 RNA 增生的時侯，原料都是微量的。我們只能在實驗的最後階段，當斑馬魚從胚胎成長為仔魚之後，才能通過觀察斑馬魚性狀的變化，確定實驗的操作是否正確。

合成 sgRNA 既然是微量的實驗，這其中就少不了要用到移液槍。為了避免空氣中和我們身體上攜帶的汙染物對生成物的純度產生影響，我們都是在精心“武裝”之後才在超淨工作台裡進行操作的。超淨工作台實際上就是一個封閉的空間加上一個過濾送風系統，戴著橡膠手套的手放在玻璃板裡面進行操作都能感到絲絲涼意。

我在這個實驗中添加了大約1.5μL 的 T7 RNA 聚合酶，這也是這次實驗中最貴的材料——每滴的售價大概要上百元。在向 DNA 模板中添加了純水、緩衝溶液、RNA 合成酶和 RNA 分解抑製劑之後，我們就將得到20μL的反應物，放到聚合鏈式反應儀中在接近人體體溫的37℃下進行大約1.5小時的增生。添加進去的就是無色透明液體，而出來的還是無色透明液體。不過根據我們所學習的理論知識，我們知道裡面已經發生了很多反應。如果我們的操作沒有出現錯誤的話，就應該生成了很多我們所需要的引導 RNA。

在配製了CRISPR 基因編輯工具的引導模塊以後，我們就可以將它和 Cas9蛋白混合在一起，得到一把人類夢寐以求的“上帝的手術刀”。

接下來就需要將溶液轉染到斑馬魚的胚胎中了。我們使用的是一種物理轉染的方法——顯微注射。注射是一個精細的過程，需要用到體式顯微鏡、顯微操作儀和數字顯微注射泵。顯微操作儀使用轉輪進行微米級的操控，而注射泵則可以控制一帕斯卡級別的氣壓，從而實現定量的精準注射。顯微注射已經成為了華大基因實驗員的基本功，每位實驗員都要一個月的集中練習才能最終實現高於95%的成功率。

對於我們初上手的學員來說，連續地轉動旋鈕進行多次注射是遙不可及的目標。能夠保證一半的胚胎存活已經實屬不易。我們組注射的不到二十枚胚胎中，只有五個存活且產生了可見的脊索性狀突變，也有的組經歷了全軍覆沒的悲傷和失而復得的喜悅。正如張晶老師所說：“這才是科學實驗真正的魅力”。

只有通過親身實踐，才能了解科學實驗的嚴謹和不易。對世界尖端科技更深入的了解給了我新的視野和啟迪。好奇心引導著人類對生命科學永不停歇地探索，我期望能夠有更多這樣的機會加入到世界前沿科技的探索當中。