Nat Med | 有望徹底根治！吳宇軒博士等通過基因編輯治療β-地中海貧血和鐮刀狀貧血疾病

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β-地中海貧血(簡稱「β-地貧」)是一種常見的由於β-珠蛋白(β-globin)亞基突變導致成人血紅蛋白(Adult Hemoglobin，HbA，由β-globin和α-globin組成)異常的遺傳性疾病。異體造血乾細胞移植可根治「地貧」，但限制條件太多，並不能得到廣泛應用。臨床發現，疾病嚴重程度與胎兒血紅蛋白(Fetal Hemoglobin，HbF，由γ-globin和α-globin組成)的含量密切相關，部分病人體內HbF較多,則併發症較輕，死亡率也低，因此，增加病人體內HbF的含量是治療或緩解這類貧血的重要方法之一。γ-globin是一種胎兒時期表達的珠蛋白，該珠蛋白具有和β-globin相似的功能，編碼該蛋白的基因HBG在上述貧血患者中序列完好，但到成年期表達便會被沉默。因此，重新激活患者體內γ-globin基因的表達來彌補缺損的β-globin是近年來興起的一種治療策略。

先前研究發現，BCL11A 基因在紅細胞中具有抑製γ-globin基因的表達的作用。這些研究提示，在患者造血乾細胞中靶向編輯 BCL11A 紅系增強子會重新激活HbF的表達，再將高效編輯後的造血乾細胞移植給患者重建造血，可產生高表達HbF的紅細胞，且不會影響淋巴細胞的分化、成熟【1,2】。

2019年3月25日，華東師範大學吳宇軒研究員、哈佛大學醫學院及波士頓兒童醫院曾靜和Daniel E. Bauer教授團隊在Nature Medicine雜誌發表題為Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells的研究論文，該研究證實通過CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術有望徹底根治由β-globin珠蛋白突變引發的系列遺傳疾病【3,4】。

首先，本研究通過比較不同的sgRNA，優化編輯系統，實現了CRISPR/Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 在人CD34+造血乾/祖細胞中的高效基因編輯，然後通過編輯紅系特異增強子BCL11A +58位點造成BCL11A在紅細胞中表達下調。在將編輯過後的CD34+細胞體外紅系分化後，發現BCL11A的表達水準顯著降低，同時HbF的含量得到極大提升。本研究還對多種地中海貧血類型的患者來源CD34+細胞進行了編輯，結果發現分化後的紅細胞分化更加成熟、體積和形態都恢復至接近於健康細胞水準。但是，研究人員發現儘管其在人CD34+細胞實現了高達80%的編輯效率，編輯後的乾細胞在移植至小鼠骨髓4個月後編輯效率卻出現了大幅度下降 (降至約平均40%) 。研究人員推測這可能是因為CD34+細胞中比例極低但是對造血乾細胞長期歸巢和增殖有關鍵作用的長期造血乾細胞 (LT-HSCs) 更不容易被Cas9編輯。因此，他們進一步優化了Cas9原核表達載體和編輯系統，使得CD34+細胞在體外的編輯效率進一步提高到了98%。

編輯後的造血乾細胞移植至免疫缺陷小鼠體內4個月後仍然保持著90%以上的編輯效率，並且能在小鼠骨髓中成功重建人源血液系統，同時分化得到的紅細胞含有高比例的HbF。另外，研究發現人長期造血乾細胞LT-HSCs在被Cas9編輯後更傾向於被非同源末端連接 (NHEJ) 的方式修復，而非微同源末端連接(MMEJ)。最後，研究人員證明了鐮刀狀貧血病人來源的CD34+細胞也能被高效編輯且在編輯後移植至小鼠體內重建人源血液系統，同時紅細胞中HbF的提升水準足以幫助細胞恢復正常形態，抵抗鐮刀化。此外，研究人員還用CIRCLE-seq鑒定了一批潛在脫靶位點，並對潛在的脫靶位點和上百個可能的白血病突變位點進行了深度測序，結果顯示這些位點並沒有出現異常的插入或缺失，證實了Cas9 RNP介導的CD34+細胞中的基因編輯是一種極其安全的治療策略。

綜上，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯β-地中海貧血和鐮刀狀貧血患者造血乾細胞中的BCL11A增強子位點，並進行自體造血乾細胞移植，可以使得體內分化產生具有高比例HbF及正常功能血紅蛋白的紅細胞，從而有可能徹底根治此類疾病。相關臨床實驗已經於2018年獲得FDA批準，由醫藥公司Vertex/CRISPR therapeutics主導，在美國和歐洲開展針對β-地中海貧血和鐮狀細胞病的I/II期臨床實驗。

通過CRISPR/Cas9基因編輯技術激活胎兒血紅蛋白HbF，結合自體造血乾細胞移植治療血紅蛋白病示意圖(Lettre and Bauer. Lancet. 2016)

我國「地貧」基因攜帶者約3000萬人，涉及近3000萬家庭、一億人口，其中重型和中間型「地貧」患者約30萬人。而由於異體造血乾細胞配型困難和血庫資源不足，這些患者很多都不能得到有效治療。因此，此項研究及其臨床實驗的推廣有望為我國β-地中海貧血患者提供全新的基於自體乾細胞移植的臨床方案，造福廣大患者和社會。

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製版人：珂

參考文獻

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