2019年3月26日/醫麥客 eMedClub/--2019年3月25日，國際著名學術期刊《Nature Medicine》在線發表了邦耀科學家吳宇軒研究員在基因治療方向的題為「Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells」的研究成果[1]。
來自華東師範大學生命科學學院吳宇軒研究員和哈佛大學醫學院及波士頓兒童醫院曾靜是該論文的共同第一作者。該研究證實通過CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術有望徹底根治由β-globin珠蛋白突變引發的系列遺傳疾病。
一
研究背景
β-地中海貧血是一種由於β-珠蛋白(β-globin)亞基突變導致患者自身的成人血紅蛋白(HbA)異常的遺傳性疾病。鐮刀狀貧血(SCD)與β-地貧致病機理類似，都是β亞基突變導致的單基因遺傳性疾病，主要癥狀為：HbA結構異常，紅細胞變形，出現典型的鐮刀形狀，無法有效通過微循環，運輸氧能力降低，出現貧血。不過鐮刀狀貧血在國內患者很少，主要發生在黑色人種中，在非洲黑人中的發病率最高，在我國的南方地區也發現有少數病例。
《中國地中海貧血防治藍皮書(2015)》的數據顯示，目前我國「地貧」基因攜帶者約3000萬人，涉及近3000萬家庭一億人口，中度至重症地貧患者約30萬人且正以每年約10％的速度遞增。我國以南方地區多見，廣西以12.22%～23.02%地中海貧血基因高攜帶率居我國首位，其次廣東、海南等省。
治療方式有限，急待新興療法出現
地中海貧血根據病情輕重，可以分為三類：輕度、中度和重度。通常情況下，輕型「地貧」無需特殊治療。中間型和重型「地貧」主要採取以下方式：除鐵治療、輸血治療、骨髓造血乾細胞異體移植、脾切除手術等。
其中，異體造血乾細胞移植是根治「地貧」的方法，但費用花費巨大，且配型極其困難；其他方法只能夠維持「地貧」患者生命，同樣給家庭帶來極大經濟負擔，且需消耗大量血液資源，患者生活質量極低，不能從源頭上根治該疾病。
基因療法有望成為新的治療選擇
近年來，基因療法的出現給患者帶來了希望，其最大的優勢在於不需要捐贈，不需要異體移植，而且一次治療可能導致永久性的「治癒」，有望取代目前並不完美的治療方案。
目前，針對地中海貧血的基因治療策略主要分為兩種，基於慢病毒整合的方式和基於基因編輯的方式。策略為：遞送功能性β-血紅蛋白基因拷貝或基因編輯組分至患者的造血乾細胞(HSC)，從此替病變的β-血紅蛋白基因完成工作。
基於慢病毒整合
針對慢病毒整合，進展速度最快的是Bluebird Bio基因療法LentiGlobin，針對輸血依賴性β-地中海貧血症(TDT)和鐮刀狀貧血(SCD)的臨床試驗分別進行到III期和I/II期，已獲得EMA的加速審評資格並且已向EMA提交了上市許可申請，有望於2019年率先在歐洲上市。
LentiGlobin是一種基於慢病毒載體的體外基因療法，該療法雖表現出極大的潛力，但是半隨機的載體整合方式，具有致癌風險；同時慢病毒中的表達原件在造血乾細胞長期歸巢和自我更新的過程中會逐漸沉默，使得療效下降，極有可能無法達到終身治癒的目的。並且這種方法需要大量病毒，即意味著巨額的花費花費較高。
基於基因編輯
對比基於慢病毒整合的方式，基於基因編輯技術的基因療法成為了一種可能成本更低、耐久性更佳的治療手段。
在歐洲，CRISPR Therapeutics/Vertex公司利用CRISPR/Cas9基因編輯技術的在研基因療法CTX001用於治療TDT正處於I/II期臨床試驗中，這也是首個由製藥公司發起的CRISPR臨床試驗，並且是歐盟批準的首個。2018年10月，美國FDA批準CTX001用於嚴重SCD的臨床試驗申請。
2019年2月25日，兩家公司宣布第一名TDT患者已在I/II期臨床研究中接受CTX001治療。與此同時，它們正在研究用於治療SCD的CTX001，並宣布第一名嚴重SCD患者已在美國參加I/II期臨床研究，預計將在2019年中期輸注CTX001。
不同於靶嚮導致疾病的缺陷基因，CTX001通過切割一種抑製胎兒血紅蛋白(HbF)表達的BCL11A基因起作用，HbF是一種可以攜帶大量氧的血紅蛋白，通常在出生時表達，成年後被置換為成人血紅蛋白(HbA)。在體外，CTX001通過電穿孔引入患者自體造血乾細胞，然後回輸到患者體內，可以產生含有高水準HbF的紅細胞，代替HbA起作用。
二
治療機理
研究發現，胎兒血紅蛋白HbF其構成為(α2γ2)，γ-globin具有和β-globin相似的功能，並且編碼該蛋白的基因HBG在貧血患者中序列完好，但到成年期表達便會被沉默。因此，重新激活患者體內γ-globin基因的表達來彌補缺損的β-globin，被認為是治療或緩解這類遺傳性貧血的一個重要策略。
基因編輯(Genome editing)技術能夠通過插入、缺失或替換的手段對基因組進行定點改造，能讓正常基因替換突變基因，從而利用基因編輯技術重新開啟胎兒期的γ珠蛋白的表達，代替有缺陷的β珠蛋白，因此很有可能成為緩解甚至治癒地貧的治療方法。
BCL11A基因的表達與γ-球蛋白表達成負相關，提示在患者造血乾細胞中靶向編輯BCL11A紅系增強子會重新激活HbF的表達，再將高效編輯後的造血乾細胞移植給患者重建造血，可產生高表達HbF的紅細胞，且不會影響淋巴細胞的分化、成熟[2-5]。基於此，上面提到的CRISPR Therapeutics/Vertex也正在進行體外基因療法的臨床試驗。
三
研究結果
基因治療地貧示意圖[6]
基於上述機理，最新研究首先通過比較不同的sgRNA優化編輯系統，實現了CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)在人CD34+造血乾/祖細胞中的高效基因編輯。接著，將編輯過後的CD34+細胞體外紅系分化後，發現BCL11A的表達水準顯著降低，同時HbF的含量得到極大提升。
對多種地中海貧血類型的患者來源CD34+細胞進行編輯的結果發現，分化後的紅細胞分化更加成熟、體積和形態都恢復至接近於健康細胞水準。
研究人員通過進一步優化Cas9原核表達載體和編輯系統，使得CD34+細胞在體外的編輯效率進一步提高到了98%，這樣就可以使得CD34+細胞中的長期造血乾細胞(LT-HSCs)得到有效編輯。
基因編輯的造血乾移植小鼠體內後，可以顯著提高紅細胞的HbF水準
編輯後的造血乾細胞移植至免疫缺陷小鼠體內4個月後仍然保持著90%以上的編輯效率，並且能在小鼠骨髓中成功重建人源血液系統，同時分化得到的紅細胞含有高比例的HbF。另外，研究發現人長期造血乾細胞LT-HSCs在被Cas9編輯後更傾向於被非同源末端連接(NHEJ)的方式修復，而非微同源末端連接(MMEJ)。
小鼠體內γ-globin表達水準在編輯前後對比
SCD患者的細胞編輯後，HbF水準提升且細胞恢復正常形態
最後，研究人員證明了鐮刀狀貧血病(SCD)人來源的CD34+細胞也能被高效編輯且在編輯後移植至小鼠體內重建人源血液系統，同時紅細胞中HbF的提升水準足以幫助細胞恢復正常形態，抵抗鐮刀化。
SCD來源CD34+細胞編輯後可抵抗鐮刀化
深度測序發現，Cas9 RNP介導的基因編輯是一種極其安全的治療方法
此外，研究人員還用CIRCLE-seq鑒定了一批潛在脫靶位點，並對潛在的脫靶位點和上百個可能的白血病突變位點進行了深度測序，結果顯示這些位點並沒有出現異常的插入或缺失，證實了Cas9 RNP介導的CD34+細胞中的基因編輯是一種極其安全的治療策略。
CIRCLE-seq和深度測序鑒定和分析脫靶位點
四
臨床意義
體外「地貧」患者造血乾細胞、老鼠疾病模型、靈長類疾病模型等數據均顯示對「地貧」疾病的徹底治癒完全有效。大量臨床數據顯示，HbF只需達到血紅蛋白總量的30%，即可完全治癒地中海貧血疾病，而此策略（通過CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯β-地中海貧血和鐮刀狀貧血患者造血乾細胞中的BCL11A增強子位點，並進行自體造血乾細胞移植）所產生的HbF比例高達40%，因此足以起到治療效果，從而有可能根治此類疾病。
與在基因治療方面處於領先地位的BlueBird Bio公司的慢病毒療法（名為LentiGlobin療法正處於臨床3期）相比，該論文的方法只需要在體外將Cas9蛋白和sgRNA通過電轉染被導入患者自體造血乾細胞，然後將其回輸到患者體內，編輯後的造血乾細胞可以分化為含有高水準HbF的紅細胞，從而治療血紅蛋白相關的遺傳疾病。
五
成果轉化
綜上所述，CRISPR/Cas9技術的出現使得我們可以通過重新開啟胎兒期的γ珠蛋白的表達，從而代替有缺陷的β珠蛋白，達到緩解地貧癥狀的目的，具有很大的臨床轉化潛力。另外，目前國內還沒有利用此方法治療地中海貧血的臨床實驗，因此有望成為世界首批進入臨床階段的基因編輯治療產品。
上海邦耀生物科技有限公司作為國內最早開展CRISPR/Cas9基因編輯技術的科研團隊，於2013年8月在國際著名期刊Nature Biotechnology上發表了描述CRISPR/Cas9系統在大鼠和小鼠上成功編輯基因的文章，而後應邀在Nature Protocol上發表了文章對CRISPR/Cas9系統的操作步驟進行了詳細闡述。2015年在Scientific Report上發文對CRISPR系統改進並實現大小鼠胚胎的大片段敲入；2016年邦耀生物利用CRIPSR/Cas9修復凝血因子F9基因突變，治療重症B型血友病取得成功，相關研究發表在EMBO；2018年再接再厲在Protein&Cell雜誌發表基因治療新武器--通過改進腺嘌呤單鹼基編輯（ABE）系統，為基因編輯技術再添完美工具。
目前邦耀生物正與華師大研究團隊積極進行科技成果轉化，與國內多家頂級醫療部門攜手，積極開展相關臨床轉化研究。我國是「地貧」疾病多發國，希望此項研究及其臨床實驗的推廣，使得基於基因編輯的基因治療成為我國β-地中海貧血患者全新的臨床治療方案，不僅可以給廣大地貧患者帶來終身健康，還可以極大減少我國血庫壓力。
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