Nature子刊：96％人群有預先存在的Cas9免疫力，CRISPR繼脫靶風險後又一挑戰丨醫麥猛爆料

今天是2018年10月31日

農曆九月二十三

醫麥客：回歸理性，踏實研究

2018年10月31日/醫麥客 eMedClub/--CRISPR-Cas9系統已被證明是一種強大的基因組編輯工具，可以精確修飾人類、動物和植物細胞內的特定DNA序列。目前，正在進行許多努力以使用CRISPR-Cas9系統來治療人類遺傳疾病，分為在體和體外治療。

近日，一項新研究表明，絕大多數人的免疫系統可能早已準備好攻擊CRISPR-Cas9基因編輯療法的關鍵組成部分。

如果這個發現聽起來很熟悉，那是因為今年1月發布的另一篇沒有經過同行評審的論文得出了類似的結論，當時CRISPR公司的股票價格應聲下跌。

這次發表在同行評審期刊Nature Medicine上的論文表明，1月份的結果不是偶然。

上：1月；下：10月（圖片來源：bioReix & Nature）

在最新的研究中，來自德國柏林Charité大學醫學院的一個科學家團隊將48名健康志願者的血液樣本暴露於CRISPR系統中最廣泛使用的Cas9酶— —SpCas9，這種酶來自一種名為化膿性鏈球菌（S. pyogenes）的細菌。

為了檢測SpCas9介導的T細胞應答，研究人員用重組SpCas9刺激人外周血單核細胞（PBMCs），並通過流式細胞術用一組T細胞標記物來分析CD3+、CD4+和CD8+ T細胞的反應性。

有趣的是，96％（46/48）的供體顯示SpCas9刺激後效應T（Teff）細胞活化。

與觀察到的SpCas9誘導T細胞活化的高速率相一致，研究人員在85％的血清樣品中檢測到針對兩種已知化膿性鏈球菌抗原中的至少一種的抗體滴度。

此外，大多數SpCas9反應性T細胞表達效應記憶（Tem）（CD4 +和CD8 +）或終末分化的效應記憶T（Temra）細胞（CD8 +）表型。這暗示機體先前暴露於SpCas9，因此SpCas9的刺激能誘導受試者的免疫記憶。

研究發現，96％受試者的血清樣品中檢測到與SpCas9反應的免疫T細胞，85％有針對它的抗體（圖片來源：Nature）

這一比例高於斯坦福大學醫學院Matthew Porteus長官的研究小組在1月份的研究報告。當時，Porteus小組發現，65％受試者體內有針對SpCas9的抗體，但無法檢測出針對該酶的T細胞活性。此外，其他團隊以前的研究表明，實驗動物也存在預先的免疫力。

Michael Schmueck-Henneresse博士長官了最新研究，他最初對96％的研究結果感到驚訝。「但這是可以理解的，因為化膿性鏈球菌是造成人類細菌感染的最常見原因之一，我們都經歷過多次感染，甚至可能被其定植。」他在一封電子郵件中寫道。

針對這項最新研究，Porteus認為，CRISPR-Cas9的免疫問題仍然值得密切關注。

其他常用的SpCas9直向同源物，如SaCas9（Cas9的金黃色葡萄球菌同源物），也會產生這種類型的免疫反應，具有相似的風險。

今年9月，發表在Cell子刊上的一篇論文顯示，在美國人群中，研究人員發現200個受試者的血清樣品中預先存在的SaCas9和SpCas9抗體的流行率分別為10％和2.5％。今年1月的論文顯示，79％血清樣品具有預先存在的SaCas9抗體，46％有抗SaCas9 T細胞。

9月（圖片來源：Cell）

CRISPR-Cas9基因治療過程中產生不受歡迎的免疫應答，可能會降低療效，並且引起安全性問題。

在這項研究中，研究團隊開發了一種測試技術，可以用來可靠地確定CRISPR-Cas9療法引起免疫反應的風險是否很低，以確保細胞產品放心使用。

該技術通過分離和擴增調節性T細胞（Treg）起作用，SpCas9特異性Treg細胞是成年人外周血中生理性SpCas9誘導的T細胞反應的固有部分，控制不需要的免疫反應。

某些患者針對Cas蛋白具有失調的Treg /Teff比率和強CD8 + T細胞應答可能對Cas相關基因治療造成限制。體外數據表明，內源性SpCas9特異性Treg細胞有可能減輕SpCas9特異性Teff的活化、擴增和功能，控制SpCas9反應性Teff反應，以便成功進行CRISPR-Cas9基因編輯。

最近的臨床前和第一次臨床數據顯示，過繼轉移的Treg細胞可以對抗T細胞的激活，也會壓倒Teff反應。因此，過繼轉移離體富集的SpCas9特異性Treg細胞或經基因改造以表達SpCas9特異性TCR的Treg細胞，有望潛在高安全風險患者的治療選擇。

此外，在進行臨床試驗之前和期間，可能有必要監測Cas酶特異性的適應性免疫應答。

體外應用

對於使用CRISPR的體外療法，僅短暫暴露於Cas酶的基因編輯可降低危險免疫事件發生的風險。如果離體時間延長，使用CRISPR-Cas系統的離體修飾可能受免疫原性的影響較小，因為基因編輯的細胞可以在Cas蛋白完全降解後輸注。

在體應用

然而，一些遺傳性疾病會產生無法在人體外修飾的基因缺陷，因此必須找到新的解決方案以防止危險免疫反應發生。

對於CRISPR-Cas的在體應用，研究人員表示，藥物開發者應盡量減少Cas9在細胞中活化的時間，可以考慮給予第一批患者預防性的免疫抑製治療。

此外，進一步的研究應該闡明Cas酶特異性Treg細胞的過繼轉移能否有效預防CRISPR-Cas編輯組織的危險炎症損傷，這將可以避免全身免疫抑製藥物的使用。

Schmueck-Henneresse博士敦促謹慎進入臨床試驗，但他同時認為，沒理由感到恐慌，這次的研究結果只是一個警告，免疫原性是基因治療領域長期存在的問題。

今年4月，本篇論文以未經同行評審的預印本形式在線發表在bioRxiv上，當時，澳大利亞國立大學的基因組編輯專家Gaetan Burgio博士在Twitter上表示，「對Cas9預先存在的免疫力比脫靶效應更令人擔憂」。

但在回復該論文最新版本的推文中，他寫道：「自預印本上線以來已經過去了6個月，CRISPR領域的發展日新月異。此後的其他工作展示了如何通過修飾Cas9蛋白或使用Cas9直系同源物來規避這一點。所以無需恐慌！」

Burgio博士圍繞免疫問題的另一種可能方法是使用其他種類的DNA切割酶。但Schmueck-Henneresse說，這可能不是一個簡單的解決方案，因為其他Cas酶來自人類經常接觸的細菌。事實上，他的團隊測試了其他酶，如Cpf1，並發現了類似的免疫反應，他建議從不知道會感染人類的細菌中尋找合適的Cas9酶。

在經歷了多次的安全問題之後，人們對CRISPR的臨床應用已經相當謹慎。

回歸理性，踏實研究，應該成為這一領域的主旋律。畢竟，還有太多的已知等待我們解釋，更多的未知等待著被發現。

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