「魔剪」剪切後，細胞如何修復？Nature子刊：沒那麼簡單

生物探索

編者按

CRISPR自問世以來一直被寄予厚望，但是對於它在細胞中的作用細節，依然有很多未知。近日，科學家們發現，過去對於「細胞在Cas9酶剪切DNA後修復基因」的假設是錯誤的，細胞修復「魔剪」造成的DNA斷裂完全不同於最初的假設。

IrvineNIST

7月27日，《Nature Genetics》期刊最新發表了這篇題為「CRISPR–Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway」文章。來自於加州大學伯克利分校的科學家們發現，一條罕見的DNA修復途徑——范可尼貧血通路（Fanconi anemia pathway）在修復由「魔剪」CRISPR-Cas9編輯造成的雙鏈DNA斷裂過程中發揮著關鍵作用。而且，范可尼貧血通路類似於「交通警察」，引導簡單的末端連接或者新的單鏈DNA傷口修補。

這項發現揭示了為什麼CRISPR-Cas9技術幾乎在所有嘗試過的細胞中都非常有效（雖然並不是所有細胞都獲得相同水準的成功），有助於幫助科研人員提高在基因組中插入新DNA（例如用正確的DNA序列替換有害的突變）的效率，並確保CRISPR編輯獲得預期的結果。

「基因編輯潛力很大，但是當前面臨很多風險和錯誤。」文章作者、加州大學伯克利分校分子和細胞生物學教授Jacob Corn強調，「它在人類細胞中的工作方式一直是一個有著很多假設的『黑匣子』。現在，我們的工作是開始解開這一謎團。」

01

CRISPR依賴於DNA修復

CRISPR-Cas9是一項革命性技術，能夠從數十億基因組中精確地提取出特定的DNA。編輯工作之後，就是細胞的自我修復了。通常，DNA修復可通過兩種方式進行：

1）非同源性末端連接（non-homologous end-joining），通過特定的酶將切開的末端縫合在一起，這一方式通常會導致一個或多個鹼基被添加或刪除，從而容易破壞基因功能，起到「基因敲除」的效果。這是CRISPR切割後最常見的結果；

2）同源介導修復（homology-directed repair），利用單鏈DNA模板，引入新的序列，對基因進行編輯。這一方式在某些類型的細胞中發生的頻率比其他類型的細胞要高，並且需要一段可以用來修補切口的DNA片段。研究人員經常提供單鏈DNA片段，並且希望細胞用它來替換有缺陷的序列。

然而，這兩個過程有點神秘，沒有人知道為什麼一些細胞更容易插入DNA，而另一些細胞卻很少這麼做。

「將CRISPR-Cas9應用於醫學或合成生物學應用的熱情是巨大的，但沒有人真正知道它植入細胞後會發生什麼。」文章一作、加州大學伯克利分校博士後Chris Richardson表示，「它會產生DNA斷裂，然後需要細胞啟動修復機制。但是我們並不了解這背後的細節。」

02

解開謎團

為了找出哪些DNA修復酶才是CRISPR剪切之後同源定向修復的關鍵，Richardson和Corn採用CRISPR干擾（CRISPR interference，CRISPRi）技術在同一時間敲除超2000個已知或者潛在的與DNA修復有關的基因。

令人驚訝的是，許多被證明很重要的基因（一旦沉默，同源定向修復會急劇下降）似乎與CRISPR沒有關係。而且，他們發現了一條罕見的基因修復通路，即范可尼貧血通路，證實其在CRISPR編輯中發揮重要作用。

范可尼貧血是一種罕見且嚴重的遺傳性疾病——源於不能產生足夠多的新鮮血細胞，臨床表現為多樣化先天畸形、進行性骨髓衰竭、色素沉著症、惡性血液系統腫瘤及實體瘤傾向。很少有病人活到30歲以上。

科學家們對這一病理研究已超10年，發現范可尼貧血通路涉及21種不同的蛋白質，一旦任意一個蛋白受損，人們就會患上范可尼貧血。此外，該通路更傾向於修復一個特定類型的DNA損傷——DNA鏈間交聯（DNA interstrand crosslinks），可輕易阻斷DNA複製、轉錄和重組，屬於毒性最強的一種DNA損傷，可以輕易殺死複製中的細胞。

20世紀80年代，研究人員曾發現，同源介導修復與范可尼貧血通路之間存在關聯，但是這一線索一直被忽略。

「根據我們的研究，我們認為，范可尼貧血通路在修復其他類型的病變中同樣發揮著重要的作用，但是最精彩的是修復雙鏈斷裂。」 Richardson表示，「在Cas9編輯之後，范可尼貧血通路可以插入新的DNA。」

03

顛覆舊識

這一發現引發了新的質疑：如果范可尼貧血通路未曾激活，細胞可能無法在基因編輯之後用正常基因替換突變的基因。事實上，范可尼貧血通路的活性水準可能會影響CRISPR精確在特定細胞中插入DNA的效率。

研究人員得出結論：雖然非同源性末端連接是雙鏈斷裂後的默認修復機制，但是范可尼貧血通路會與之競爭，活性越高會導致更多的同源介導修復、更少的端連接。

04

研究意義

這些發現不僅有助於科學家們更好地了解細胞的DNA修復機制，還可以幫助他們開發針對癌細胞DNA修復的抗癌療法。

Richardson發現，關聯范可尼貧血通路的21種蛋白質中的FANCD2蛋白總是位於CRISPR-Cas9創建的雙鏈斷裂的位置。這意味著，FANCD2在調控新DNA插入基因組剪切位點中發揮著重要作用。科學家們推測，FANCD2可以被微調，從而提高細胞通過同源定向修復插入DNA的頻率。

「此外，考慮到FANCD2位於Cas9剪切的位置，我們或許可以利用FANCD2來繪製Cas9在任何細胞類型中切割的位置。」 Richardson設想道。

科學家們可以對參與這一通路的蛋白質進行「人為調整」，優先引導DNA置換結果，這對於基因治療遺傳疾病很重要。

「如果你想要治療鐮狀細胞貧血，成功率與你使用正確的基因替換缺陷基因的效率密不可分。」Richardson解釋說，「如果你從病人身上採集一百萬個細胞，最終獲得10%的插入率，自然沒有30-40%那麼好。」

責編：風鈴

TAG: |