隱匿性乙型肝炎病毒感染再認識

隨著精準醫療概念的提出，更加嚴謹地對隱匿性乙型肝炎病毒感染人群進行定義、診療及管理，將對HBV的防控有重要的意義。今天小編為大家推出魯鳳民，廖昊，劉永振，竇曉光在中華預防醫學雜誌2019年第5期發表的題為《隱匿性乙型肝炎病毒感染再認識》的文章，筆者就隱匿性乙型肝炎病毒感染的發生機制、流行趨勢和定義的演變進行了詳細探討，並提出對其定義的理解以及檢測的改進方法。

題目：隱匿性乙型肝炎病毒感染再認識

¹¹¹²¹²中國醫科大學附屬盛京醫院感染科，瀋陽 1100216

通信作者：魯鳳民，Email：[email protected]，電話：010?82805136

摘要: 乙型肝炎病毒（HBV）感染是我國重大的公共衛生問題，我國曾經是HBV感染高流行區，而且存在一定比例的HBV易感染人群和既往感染，單項抗-HBc陽性人群，特別是在40歲以上人群中比例較高，其中一些人可能為HBV隱匿性感染者（OBI）。OBI臨床診斷較困難，但這種隱匿感染卻可使疾病慢性進展，最終導致肝硬化，甚至肝細胞癌的發生。在免疫機能下降或進行免疫抑製治療時可能導致OBI患者HBV的復燃。而且，OBI患者是潛在的HBV傳染源，可通過輸血、器官移植和母嬰密切接觸等方式進行傳播。針對這一現狀，我們對OBI的發生機制、流行趨勢和定義的演變進行探討，並提出我們對OBI定義的理解以及檢測方法的改進，希望對OBI人群的診療及管理和HBV的防控有所益處。

關鍵詞 :乙型肝炎病毒;隱匿性感染;病毒複製;整合

DOI:10.3760/cma.j.issn.0253?9624.2019.05.002

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是我國病毒性肝炎及相關肝臟疾病的主要原因之一。乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）是HBV感染的主要血清學標誌物，血清HBsAg檢出陽性即可診斷為HBV感染，持續檢測陽性超過6個月則可被診斷為慢性HBV感染。慢性HBV感染除了HBsAg陽性外，血清中往往還能檢測到乙型肝炎病毒e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）或其抗體，病毒基因組DNA，以及乙型肝炎病毒核心抗體（hepatitis B core antibody，抗-HBc）。其中抗-HBc在感染病毒被清除後仍可長期存在，單獨抗-HBc陽性往往被認為是既往感染。隨著檢測技術的完善、特別是核酸檢測靈敏度的提高，人們在臨床實踐過程中發現，有些個體的血清用商品化的試劑盒不能檢測出HBsAg，但其肝臟或血液中卻可以檢測出低水準的HBV DNA，這一現象稱為隱匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）。OBI不僅可以造成臨床診斷失誤，與之相關的持續性的輕微的肝細胞炎症壞死，可導致慢性肝病進展，長期積累可導致肝硬化和肝癌發生。在免疫機能下降或進行免疫抑製治療時可能導致OBI患者HBV的復燃；而且，OBI患者是潛在的HBV傳染源，可通過輸血、器官移植和母嬰密切接觸等方式進行傳播。

一、OBI的可能發生機制和流行現狀

對於OBI發生機制，人們提出了如下幾種可能：（1）HBV基因突變：首先S區突變可導致抗原決定簇構象的改變，從而導致檢測的失敗，尤其是主要親水區中"α"決定簇的突變，如G145R、Q129R和M133T，均可導致蛋白構象的改變¹。其次，HBV基因組突變導致HBsAg的表達和分泌減少²，血清中HBsAg水準低於檢測限而導致無法檢測出。（2）HBV表觀遺傳變異：Vivekanandan等³研究發現肝細胞感染HBV時可通過上調DNA甲基轉移酶的表達量，促使HBV CpG島甲基化，從而抑製HBV複製與表達。（3）血清中HBsAg和乙型肝炎病毒表面抗體（hepatitis B surface antibody，抗-HBs）形成免疫複合物：導致無法檢測出HBsAg。（4）丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）與HBV合併感染：HCV核心蛋白可通過與HBX蛋白和聚合酶之間的作用抑製HBV基因表達和複製^[⁴，在我國HCV與HBV合併感染也受到關注^[⁵^]。（5）宿主免疫控制：宿主免疫系統抑製HBV的複製，導致HBsAg無法檢測出。例如急性HBV感染自限性恢復後，HBV可作為隱匿性感染長期存在^[⁶^]；部分HBsAg陽性母親所生嬰兒免疫阻斷後雖然HBsAg陰性且符合目前HBV母嬰阻斷成功的標準?^[⁷^]?，但其血清中HBV DNA檢測陽性，提示這些嬰兒免疫阻斷後可能存在OBI^[⁸^]。OBI的形成機制眾多，但大部分研究者所認為它的形成往往並不是單因素作用的結果，而是HBV病毒因素和宿主因素相互作用導致。
一般OBI患者都曾經有既往HBV感染、甚至慢性乙型肝炎史，可能由於病毒變異、治療或宿主因素導致HBsAg無法檢出。一項研究發現，在HBV較低流行的法國，OBI的檢出率是1.2%（47/3 966），所有OBI檢出抗-HBc陽性^[⁹^]。由此可見，HBV的高感染流行率是OBI存在的基礎。我國曾經是HBV感染高流行區，而且存在一定比例的HBV易感染人群^[¹⁰^]，2006年我國的血清學調查顯示，1~4歲兒童單抗-HBc陽性率為4.1%，50~59歲人群單抗-HBc陽性率高達46.6%~53.4%，在我國1~59歲人群中的總體單抗-HBc陽性率為34.1%^[¹¹^]。目前，我國的OBI感染流行情況尚不完全清楚。有文獻報導，我國單抗-HBc人群中，OBI的流行率高達33.3%，顯著高於陰性人群的7.6%^[¹²^]。一項對獻血人員的研究發現，我國獻血者OBI發生率約為0.094%（1/1 063）^[¹³^]。一項國外研究發現，在單抗-HBc陽性人群OBI的檢出率更高達52%^[¹⁴^]。此外，需要注意的是，隱匿性感染流行率也受診斷試劑靈敏度的影響。例如，HBsAg檢測試劑靈敏度的提高及其檢測逃逸突變能力的提高將提高OBI診斷的準確性，另一方面，HBV DNA檢測靈敏度也將影響OBI檢出率。近年來，由於HBV DNA檢測方法的靈敏度提高，越來越多的OBI被發現，也逐漸被重視。

二、OBI認識的演變

自1978年Hoofnagle等[15 ]首次發現HBsAg陰性和抗-HBc陽性獻血者血液可使受血者感染HBV，據此提出了隱匿性感染可能導致HBV傳播的觀點。最初，OBI的診斷主要依賴於HBV血清學標誌物和病毒DNA的檢測^[¹⁶¹⁷¹⁸^]。隨著對OBI認識的不斷深入，人們發現血清HBV DNA的檢測不能完全反映和判斷OBI，並提出檢測肝組織中HBV DNA可能是評價和診斷OBI更可靠的方法^[¹⁹²⁰²¹^]。2007年Raimondo等^[²²^]提出通過使用巢式PCR檢測肝組織或血清中HBV基因組的不同區域，可提高OBI檢測的靈敏度和可靠性。目前，被廣泛接受的OBI定義是2008年義大利召開的歐洲肝臟研究協會（European Association for the Study of the Liver，EASL）的"Taormina OBI專題會議"提出：排除HBV窗口期感染，按照現有血清學檢測技術檢測HBsAg陰性，但肝組織中HBV DNA陽性，對應血清HBV DNA低於檢測下限或低值陽性（<200 IU/ml）^[²³^]。隨著擴增技術的發展，巢式PCR、real-time RCR以及液滴數字PCR都被用於OBI的實驗室診斷。這些方法均仍採用對肝組織或血清病毒基因組多個區域的特異性檢測，兩區及以上檢出陽性為診斷OBI的標準^[²³^]。

三、HBV的複製周期及基因組形式

HBV基因組結構是由長鏈L（負鏈）和短鏈S（正鏈）組成的不完全雙鏈鬆弛環狀DNA（relaxed circular DNA，rcDNA），基因組全長約3.2 kb，是目前已知的感染人類的最小DNA病毒。HBV DNA序列有四個開放讀碼框（open reading frame，ORF）：Pre-S/S、Pre-C/C、Pol和X，分別編碼HBsAg（大蛋白，中蛋白，小蛋白）、HBeAg和核心蛋白（hepatitis B core antigen，HBcAg）、P蛋白和X蛋白。在病毒感染過程中，進入細胞內的HBV核衣殼脫去衣殼，HBV rcDNA進入細胞核並在細胞DNA聚合酶等的作用下，修復形成完整的雙鏈超螺旋的共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）。HBV病毒複製存在獨特的逆轉錄過程，轉錄自cccDNA的超基因組全長的3.5 kb前基因組RNA（pregenomic RNA，pgRNA）既能翻譯合成HBcAg和P蛋白，又可作為病毒逆轉錄合成病毒負鏈DNA的模板。在核衣殼內P蛋白以pgRNA為模板，通過其逆轉錄酶活性逆轉錄出全長的病毒負鏈DNA，與此同時，pgRNA在P蛋白RNA酶H活性作用下被降解；之後病毒以新合成的負鏈DNA為模板，在P蛋白DNA聚合酶活性作用下再合成互補的正鏈DNA。成熟的核衣殼即可獲得包含HBsAg的外包膜，裝配成完整子代病毒顆粒，以丹氏顆粒的形式釋放至肝細胞外形成子代病毒，這些新合成的rcDNA也可重新進入細胞核補充cccDNA池。在過去很長的一段時間內，人們一直在嘗試建立可靠的cccDNA特異的檢測方法，這些方法主要基於酶切消化rcDNA加跨雙缺口的PCR擴增策略^[²⁴^]。但是既往的許多研究和我們實驗室近期的研究結果表明，單純以rcDNA做模板，在選擇性的核酸酶（如PSAD、T5或Exonuclease Ⅲ）消化後，雙跨缺口PCR仍然能夠進行有效擴增，表明傳統的cccDNA檢測方法並不能完全排除開鏈環狀的rcDNA的干擾^[²⁵^]。近期液滴數字PCR的引入一方面顯著提高了cccDNA的檢測靈敏度^[¹⁴^]，但同時也使得rcDNA對cccDNA檢測的干擾更為嚴重。

四、HBV整合對OBI診斷的干擾

目前已知，HBV的DNA有多種存在形式。在具有完全感染活性丹氏顆粒中，病毒基因組以rcDNA形式存在，在感染肝細胞核內則以cccDNA存在。cccDNA既是病毒複製的模板，其持續存在也是HBV慢性感染的病毒學基礎。HBV雙鏈線性DNA（double stranded linear DNA，dslDNA）則是病毒發生整合的主要形式，但由於其線性特徵，整合的HBV DNA失去了形成超過基因組長度的pgRNA的能力，不能作為子代病毒複製的模板。而rcDNA既是子代病毒丹氏顆粒基因組的存在形式，也是補充和維持cccDNA池的來源。據此，我們認為，只要能夠將失去病毒DNA複製能力的整合DNA片段與具有產生子代HBV基因組能力的cccDNA或rcDNA區分開來即可。近年來，人們逐漸意識到，HBV DNA的宿主基因組整合是病毒感染早期發生的事件^[²⁶^]，Mason等^[²⁷^]的研究發現，多至0.1%~1%的肝細胞存在HBV DNA的整合。所以，有學者認為OBI檢測應該注意HBV整合的干擾，檢測到HBV DNA片段並不意味著可作為病毒完整基因組的核酸存在^[²⁸²⁹^]。據此一些實驗室和我們均建議，OBI的診斷應該基於具有HBV複製能力的完整病毒核酸的檢測，排除HBV整合DNA片段帶來的干擾^[²⁵^]。我們前期實驗結果表明，整合HBV DNA片段端主要集中在HBV直接重複區（direct repeat，DR）1和DR2附近^[³⁰^]，也是HBV基因組的Gap（缺口）區1592~1826附近，與dslDNA是發生HBV整合的主要來源一致^[³¹^]。HBV的複製存在逆轉錄過程，由cccDNA轉錄產生的pgRNA經逆轉錄合成病毒DNA負鏈，再經正確跳轉後開始合成正鏈，形成鬆弛環狀雙鏈DNA（relaxed circular DNA，rcDNA），構成成熟子代病毒顆粒的基因組^[³²^]。由於3.5 kb的超基因組長的pgRNA只能來源於cccDNA，所以rcDNA的存在不僅間接反映了cccDNA的存在，更提示其處於轉錄活躍狀態。因rcDNA是成熟子代病毒顆粒的基因組同時也包含病毒全部遺傳信息，且cccDNA是其唯一來源，我們認為，cccDNA和/或rcDNA的存在均表徵了HBV發生病毒再激活和再感染的潛能。因此，在排除了整合HBV DNA的干擾之後，不論是rcDNA檢出陽性、或是cccDNA檢出陽性，均可以被認為是OBI。為此我們建立跨缺口數字PCR方法並申請專利，該方法只能檢測rcDNA和cccDNA，而不能擴增HBV整合片段。如圖1 所示，該方法結合了數字PCR高靈敏度的特性，特別適用於OBI低病毒載量患者的檢測。

RcDNA：鬆弛環狀雙鏈DNA；cccDNA：共價閉合環狀DNA；

HBV：乙型肝炎病毒；dslDNA：雙鏈線性DNA；DR：直接重複

序列；「-」：HBV負鏈DNA；「+」：HBV正鏈DNA

儘管依賴於肝組織的rcDNA或cccDNA的OBI診斷準確可靠，但由於肝穿是有創檢查，而OBI人群癥狀較輕，在臨床實踐過程中難以廣泛通過肝穿來診斷OBI。單獨抗-HBc陽性是OBI人群最主要血清學表現形式之一，約佔OBI人群的80%^[³³^]。有研究發現，由於肝組織存在微量的病毒複製刺激宿主免疫，高水準的抗-HBc與肝組織的cccDNA水準相關^[¹⁴³⁴³⁵^]。血清學指標抗-HBc水準是否可以用來初步判斷OBI存在與否值得進一步的研究。

七、小結

總之，隨著核酸檢測技術以及新血清學指標的發展，對OBI的認識和檢測手段有了新的變化。血清HBsAg陰性，肝組織中HBV DNA陽性的OBI定義略微模糊，隨著精準醫療概念的提出，我們建議OBI的定義也應該更加嚴謹的被定義為：排除HBV窗口期感染，按照現有血清學檢測技術檢測HBsAg陰性，但肝組織中HBV rcDNA或cccDNA陽性，對應血清HBV DNA低於檢測下限或低值陽性（<200 IU/ml）。OBI人群的診療及管理，對於HBV的防控有重要的意義。

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