NEJM綜述：基因編輯治療的起源、進展和臨床試驗

本文轉載自「NEJM醫學前沿」。

圖片來自於：pixabay

2019年3月7日，《新英格蘭醫學雜誌》（NEJM）發表了題為《一類通過DNA編輯發揮作用的新型藥物》（A New Class of Medicines through DNA Editing）的綜述，介紹了基因編輯的發展，討論了將其作為治療手段療效、特異性、輸送和安全性對於所不可或缺的作用。我們在此簡介綜述中的主要內容。

基因編輯的早期發展

1994年Jasin等發現，用核酸酶使靶基因中的DNA雙鏈斷裂，並且在斷裂的同時提供供體DNA模板，可以提高基因編輯的效率。這一發現表明可通過同源重組在突變位點插入新序列，同時還表明可通過稱為非同源末端連接（NHEJ）的過程在斷裂位點產生新突變。DNA中特定的雙鏈斷裂可誘導修復這一發現，奠定了基因組編輯領域的基本原理。

已經用於基因編輯的核酸酶技術主要有歸巢核酸內切酶-兆核酸酶、鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄活化因子樣效應核酸酶（TALEN）和與Cas9核酸內切酶相關的成簇的規律間隔的短迴文重複序列（CRISPR-Cas9），目前應用較為廣泛的是TALEN和CRISPR-Cas9系統。

準確的切割和修復

現在大紅大紫的CRISPR-Cas9系統的發現得益於科學家對細菌適應性免疫系統的研究。由於基因組編輯中僅使用細菌系統的兩個成分，即Cas9核酸酶（最常用的Cas9酶來自產膿鏈球菌）和嚮導RNA（gRNA），因此稱該方法為Cas9-gRNA系統更為準確。在基因組編輯中，gRNA與DNA靶位點結合後，Cas9核酸酶受誘導發生構象變化，之後將DNA切割。gRNA序列的設計簡單方便，易於優化與特定DNA靶位點的雜交，從而通過DNA鹼基配對將Cas9-gRNA「引導」至其靶位點。

經過核酸酶切割的DNA必須通過某種機制被細胞修復。基因編輯涉及到的修復機制為非同源末端連接（NHEJ）和同源介導的雙鏈DNA修復（HDR）。

高效的遞送系統

為了實現高效編輯，必須在不激活細胞毒性反應的情況下，將足量具有良好特異性的高活性核酸酶輸送入細胞核內。對於具有完整的抵抗外源DNA和RNA的原代人細胞，必須以mRNA（進入細胞後被翻譯）或核糖核蛋白複合物（例如Cas9-gRNA）的形式輸送核酸酶。新型的重組腺相關病毒載體可以在向細胞核輸送單鏈DNA時避免被細胞探測到。電穿孔是離體輸送這些分子的一種有效且相對無毒的方法。

一些靶向特定通路的小分子可以增強HDR介導的細胞內編輯。但是，某些乾預措施干擾了細胞的正常修復方式或應對雙鏈斷裂的方式，從而可能損害對在細胞周期中自然發生的20~40個雙鏈斷裂的修復能力。

輸送核酸酶過程中的其他方面也需要考慮。例如，雖然在將核酸酶輸送至原代人細胞方面，mRNA優於質粒DNA，但mRNA可誘發抗病毒Ⅰ型干擾素應答。此外，核酸酶的長期表達或低特異性核酸酶的表達可激活p53通路，從而觸發細胞周期停滯和細胞凋亡。

讓細胞變成藥物

在所有基因組編輯方法中，目前發展最成熟的是離體基因組編輯，即在體外對細胞進行基因工程改造，然後將細胞回輸到患者體內。近年，以中美兩國為代表的團隊已經開展了一些基因編輯的臨床試驗，例如：產生更強效的CAR T細胞，用於治療癌症；敲除BCL11A的紅系特異性增強子，以上調自體紅系造血乾細胞中的γ球蛋白，作為鐮狀細胞病和β-地中海貧血的潛在療法。臨床前研究提示，針對某些疾病（例如慢性肉芽腫病、X連鎖重症聯合免疫缺陷、X連鎖高IgM綜合征和HIV感染）的離體、自體、基於細胞的基因組編輯將取得較好療效。

目前有14項已結束或進行中的ZFN試驗，8項TALEN，以及12項CRISPR-Cas9。大多數有關ZFN的臨床前研究已經發表並經過同行評議。

雖然體外細胞編輯已經取得了一定的療效，但是仍然存在很多局限性，比如尚無將經過基因編輯的細胞移植到肝臟或腦的可靠方法。對於那些無法應用體外編輯治療的疾病，體內編輯，即將編輯裝置輸送到患者體內從而在自然條件下對細胞進行編輯，可能發揮重要作用。

但是人體自身免疫系統對體內編輯是一個很大的障礙。所有主要核酸酶平台均包含外源蛋白。因此，長期表達核酸酶可能誘發適應性免疫應答。此外，首劑給葯可能導致患者對之後的給葯產生免疫力。Cas9-gRNA系統中使用的Cas9核酸酶來自兩種細菌（產膿鏈球菌和金黃色葡萄球菌）中的一種。由於每種細菌均在人群中有普遍感染，因此大部分成人之前就對Cas9有免疫力。

棘手的安全性評估

核酸酶介導的基因組編輯會導致雙鏈斷裂，這是基因組不穩定性的一個來源，而基因組不穩定性可能導致致癌性突變。縮短核酸酶的表達持續時間（例如以核糖核蛋白複合物的形式輸送Cas9-gRNA）、改變核酸酶的結合和催化活性可改善特異性。

評估基因組編輯安全性的一個關鍵問題是評估其準確率或脫靶率，但目前尚無經過驗證的臨床前檢測方法。基因組內持續發生自發隨機斷裂，而經基因工程改造，能夠改變大量細胞的核酸酶可能會促進在靶斷裂和其他部位自發隨機斷裂之間的易位。現有檢測方法的靈敏度不足以檢測到這些事件的發生頻率，而且也無法評估DNA斷裂的功能性後果。另外，每個人的基因組在基線時就存在數百萬個微小差異，這使得難以評估核酸酶產生的潛在小變化的後果，使特異性評估進一步複雜化。

雖然有不同方法（例如生物信息學、細胞捕獲和體外檢測）可識別哪些位點可能有脫靶插入或缺失，但每種方法均有其固有的偏差。使用動物模型預測基因工程安全性也不是預測臨床試驗中安全性的有效方法。所以，目前的最佳方法是在仔細控制的1期臨床試驗中評估基因編輯的安全性。

臨床應用

單基因疾病

基因編輯目前已經能夠進行高頻率的基因修正，因此理論上可以應用於造血系統和免疫系統的數百種遺傳病（如鐮狀細胞病、X連鎖重症聯合免疫缺陷和X連鎖慢性肉芽腫病）。雖然也可通過基因組編輯對其他器官系統的單基因疾病進行基因「修復」，但仍存在分離、擴增、移植組織特異性乾細胞（用於離體治療）以及將基因組編輯工具輸送到患病組織內等困難。

免疫腫瘤學

基因組編輯在臨床試驗中已被用於改進CAR T細胞療法。NHEJ介導的編輯可通過敲除TCRA（編碼TCRα）來去除T細胞的同種異體反應性，也可通過敲除B2M（編碼β2-微球蛋白）來去除免疫原性，還可以移除抑製細胞功能的分子或者促進細胞耗竭的分子，從而增加細胞的效力。HDR介導的編輯可確保將基因插入特定基因座內。

再生醫學

迄今，細胞療法還未能利用細胞或乾細胞替換或修復患病、受損或老化的組織。基因組編輯提供了改造細胞、增加細胞效力和安全性的方法，比如使細胞分泌預防神經退行性疾病的保護因子等。

合成生物學

合成生物學涉及通過基因工程改造細胞，使其獲得正常情況不具有的功能。目前可以對細胞進行基因編輯，以分泌治療性蛋白，以及利用細胞影響動物生理。將基因組編輯和合成生物學相結合的例子包括通過基因工程改造細胞，使其分泌促紅細胞生成素或傷口癒合生長因子。以後還有可能通過基因工程改造細胞，使其分裂、遷移、應答、發出信號和分泌，從而對患病組織環境起到治療作用。

技術有了，如何妥善利用？

通過採用適當的監管措施（目前並非所有的國家都有），在人體極早期發育中使用基因組編輯，可能讓我們在人類胚胎髮育領域獲得重要且出乎意料的發現。這種研究應該得到鼓勵，但我們不應允許其應用於提高人體的某項功能，例如例如使得健康人獲得與治療或預防嚴重疾病無關的性狀。人們普遍認為，對人類基因組編輯的應用持續進行廣泛而透明的討論非常重要。

2018年11月被曝光的人類胚胎基因編輯事件，是不符合倫理、不負責任和不顧後果的，並且嚴重違反了關於基因組編輯應用於人體胚胎的廣泛國際標準。制定可供引用的國際標準是目前的迫切需求，標準的頒布有利於阻止未來可能發生的更多的魯莽做法。

基因組編輯是一種變革性的產生藥物手段。但是作為一種新興的技術，我們還應謹慎對待。目前，應該首先考慮將其應用於嚴重疾病，並且在應用中關注更多細節問題。經過不斷的改良和迭代，確認其安全性及有效性後，才應該考慮用於較輕微的疾病。

End

TAG: |