Science長文 | Bruce Beutler團隊發現淋巴細胞發育中負控Wnt通路的關鍵因子

撰文 | 陳皮

責編 | 兮

Wnt/β-catenin通路是一條在生物進化中高度保守的信號通路，在生長、發育、代謝和乾細胞調節等生物過程中發揮著重要的作用，是調節機體生長髮育的重要信號通路之一。

機體造血系統中含有多種不同類型的細胞，它們各自肩負著不同的生理功能。其中，來自淋巴系或髓系的血細胞均是由造血乾細胞產生的。造血乾細胞（Hematopoietic stem cell， HSC）是各種血細胞的始祖細胞，擔負著維持和重建造血的重要生理功能。HSC具有兩個重要特徵，自我更新和多潛能性分化，其多潛能性分化特性確保它具有生成各類血液細胞的能力，而自我更新特性則保證其不斷地產生新的HSC以維持整個生命周期中造血的經久不衰。HSC的功能異常則會導致許多血液系統疾病的產生。因此，對調控HSC自我更新的機制的研究始終是領域內的熱點。

圖片引自：https://mindthegraph.com/profile/matheusczizeweski1/infographic-75725#/

在過去20多年裡，研究人員發現在造血系統中，經典的Wnt/β-catenin信號通路和非經典的Wnt信號通路（Wnt/JNK信號通路和Wnt/Ca²⁺信號通路）可以調控HSC的自我更新、T淋巴細胞B淋巴細胞的增殖發育，以及T細胞的活化，從而對機體免疫系統起到重要的調控作用【1】。在淋巴細胞中，Wnt蛋白作為生長促進因子發揮作用的同時也影響細胞的命運決定，包括凋亡和靜止【2】，研究表明，腺瘤性息肉病基因APC（adenomatous polyposis coli）的亞等位基因缺失會導致T淋巴細胞譜系中Wnt/β-catenin信號通路異常激活，造成成熟T細胞自發激活和凋亡，導致T細胞淋巴球減少症的產生【3】。

鑒於Wnt信號通路廣泛的重要性，機體記憶體在著包括負反饋調節蛋白ZNRF3（zinc and ring finger 3）和其同源RNF43（ring finger 43）在內的反饋調節機制以便於更好的維持機體穩態。這些跨膜E3泛素連接酶特異性地促進FZD（捲曲蛋白，frizzled protein）細胞質環結構上的賴氨酸殘基泛素化，使FZD被溶酶體降解，從而減弱Wnt信號【4】。儘管研究表明Wnt信號通路在免疫中發揮著重要的作用，但是針對Wnt通路在特異性調控淋巴生成的過程中是否存在負反饋調節因子尚未明確。

近日，Science雜誌在線發表了來自美國德克薩斯大學西南醫學中心Bruce Beutler（2011年諾貝爾生理學或醫學獎得主）團隊的研究論文LMBR1L regulates lymphopoiesis through Wnt/β-catenin signaling，研究團隊發現Lmbr1l（limb reigon 1-like gene）隱性亞等位基因突變會導致小鼠血液中T細胞比例降低，進而發現LMBR1L的缺失會引起Wnt/β-catenin信號異常激活，導致小鼠所有淋巴系發育受損和功能缺陷。該研究揭示了LMBR1L是淋巴細胞生成活化過程中Wnt/β-catenin信號通路的關鍵負調控因子。

研究人員首先利用乙基亞硝酸脲誘導小鼠突變產生，通過正向遺傳篩選（BioArt註：也只有Bruce Beutler團隊這種年均擁有上千萬美金研究經費的實驗室才能如此大方的在小鼠中做大規模正向遺傳篩選），發現了Lmbr1l基因隱性亞等位基因突變會導致淋巴細胞發育和功能受損。對Lmbr1l突變小鼠表型的進一步分析發現小鼠體內所有淋巴系發育受損嚴重，免疫抗體應答能力受損，並且細胞毒性T淋巴細胞殺傷活力下降，自然殺傷細胞（NK）功能下降，其對鼠巨細胞病毒感染具有耐性。LMBR1L缺失T細胞更易發生凋亡，並且會因應答抗原特異性或穩態擴張信號而死亡。此外，研究人員發現突變小鼠的造血乾細胞向淋巴系多能前體細胞（LMPP，lymphoid-primed multipotent progenitor）和常見的淋巴系祖細胞群（可向T細胞，B細胞還有自然殺傷細胞分化）分化過程中出現了損傷。

接下來，研究人員探討了Lmbr1l在淋巴細胞發育中的分子功能和機制。LMBR1L蛋白包含9個跨膜結構域，細胞成分分離實驗結果表明，LMBR1L主要在內質網（ER）部分含量較高。採用免疫共沉澱法結合質譜分析的方法，研究人員對與LMBR1L相互作用的蛋白進行分析，發現LMBR1L與參與Wnt/β-catenin信號通路的許多蛋白組分存在相互作用，包括ZNRF3，LRP6，β-catenin，甘糖合成酶激酶（GSK-3α），還有GSK-3β，以及參與內質網相關的蛋白質降解（ERAD， ER-associated degradation）途徑的蛋白質UBAC2，TERA（transitional ER adenosine triphosphatase），UBXD8，GP78（glycoprotein 78）。

來自Lmbr1l^-/-小鼠的原始CD8⁺細胞表現出β-catenin蛋白水準升高以及Wnt受體EZD6和共受體LRP6的成熟形態。研究人員認為這些影響是由於內質網上的LMBR1L-GP78-UBAC2複合物未能成功傳遞降解β-catenin，FZD6和LRP6的信號。同樣的，可以在Gp78^-/-的原始CD8⁺T細胞中檢測到β-catenin表達水準上升以及成熟態的FZD6和LRP6。此外，在原始CD8⁺細胞中多種「破壞複合體」組分（Axin1，DVL2，β-TrCP，GSK-3α和-3β，CK1）蛋白水準降低。值得注意的是，敲除Lmbr1l^-/-的T淋巴瘤細胞系EL4細胞中的β-catenin在很大程度上拯救了細胞增殖潛能並減少了由LMBR1L缺失而引起的細胞凋亡。

LMBR1L缺陷小鼠淋巴細胞分化發展到LMPP階段和隨後的所有淋巴細胞定向階段均存在著損傷。內質網上的LMBR1L-GP78-UBAC2複合體穩定β-catenin破壞複合體的結構並且促進泛素介導的β-catenin和Wnt受體的降解。LP,淋巴祖細胞，APC，腺瘤性息肉病蛋白，P，磷醯基。

總的來說，本研究表明了存在一種LMBR1L參與的調節淋巴細胞中Wnt/β-catenin信號通路活性的途徑。LMBR1L缺失引起Wnt/β-catenin信號異常激活，導致小鼠淋巴系細胞發育和功能受損，這可能也是機體對Wnt/β-catenin通路精確調控的需要。此外，研究發現了這一精密製動系統的另一組成部分，即在內質網上存在的LMBR1L-GP78-UBAC2複合體可通過獨立於配體結合調節Wnt受體的方式調控淋巴細胞Wnt信號的活性。LMBR1L能夠穩定以及包括GSK-3α在內的經典的破壞複合體，促進β-catenin的降解以及LRP6的活化。

最後，因為人類和小鼠LMBR1L具有很高的同源性（96%），在人淋巴細胞和其祖細胞中可能也是相同的機制在行使調控作用。同時，LMBR1L缺乏可能是原因不明的泛淋巴性免疫缺陷疾病的病因之一，這也為臨床上的疾病治療提供了理論支持。（上圖）

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製版人：珂

參考文獻

1. S. Verbeek et al., An HMG-box-containing T-cell factor required for thymocyte differentiation. Nature 374, 70–74 (1995).

2. R. Nusse, H. Clevers, Wnt/b-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell 169, 985–999 (2017).

3. C. Wong, C. Chen, Q. Wu, Y. Liu, P. Zheng, A critical role for the regulated Wnt-Myc pathway in naive T cell survival. J. Immunol. 194, 158–167 (2015).

4. H. X. Hao et al., ZNRF3 promotes Wnt receptor turnover in an R-spondin-sensitive manner. Nature 485, 195–200 (2012).