【繼教園地】外泌體在白血病發病機制中的作用

外泌體是由細胞產生的細胞外囊泡，作為細胞間通訊的媒介之一，廣泛存在於多種體液中，其產生、成熟以及分泌的過程都受到嚴密的調控。除了外泌體包膜上的蛋白能起到細胞間信息傳遞的作用，外泌體傳遞的內容物也具有重要的生理功能。2007年發表的1篇里程碑式工作證實了外泌體攜帶的mRNA在受體細胞內具有生物學活性，仍能發揮其蛋白翻譯功能。近年的研究表明，mRNA並非是唯一的能在受體細胞中發揮生物學功能的分子，包括microRNA/long-non coding RNA、DNA及蛋白質在內的生物學分子都能通過不同方式在受體細胞中發揮其生物學功能。也有一些研究提示外泌體可能參與了其他細胞器的水準傳遞，證實在純化後的外泌體中存在有功能的線粒體成分，並且這與乳腺癌的腫瘤細胞耐葯相關。

近年來的研究表明外泌體參與了眾多的生理及病理過程，尤其是在腫瘤研究中，外泌體被證實與多種腫瘤的進展、轉移和治療反應性等密切相關。白血病患者體液與培養的白血病細胞上清中，都可以見到升高的外泌體分泌水準，雖然升高的外泌體並非都來源於白血病細胞，但其高表達白血病細胞的表面分子（如CD34和CD117等）這一特點，表明升高的外泌體至少部分來源於白血病細胞。對於白血病細胞來源的外泌體研究較多，其可通過不同方式調控白血病細胞自身生物學行為及影響正常的造血功能。此外，也有部分工作關注到了非白血病細胞來源的外泌體在白血病中的作用。這裡，我們對白血病微環境中外泌體的作用綜述如下。

一、白血病細胞通過自分泌的方式

介導對白血病細胞自身的調控作用

白血病細胞來源的外泌體分泌後可作用於多種受體細胞，也能以自分泌的方式作用於自身，增強自身的增殖及乾性。慢性髓性白血病（CML）細胞系LAMA84分泌的外泌體通過TGF-β1，以自分泌的方式作用於自身的受體，活化抗凋亡相關通路，從而增強體外的集落形成能力，將LAM84細胞接種到NOD/SCID小鼠皮下，並在接種腫瘤部位進行外泌體注射，這些小鼠的腫瘤重量明顯高於注射PBS的小鼠。這樣的自分泌作用方式不僅見於白血病細胞系，同時也見於患者的原代細胞及小鼠模型中。通過對慢性淋巴細胞白血病（CLL）患者的外泌體蛋白質進行分析發現，白血病細胞通過增加S100蛋白的分泌，從而活化自身胞內的NF-κB信號通路，從而加速疾病進程。瀰漫大B細胞淋巴瘤細胞通過Wnt信號通路的活化介導側群細胞與非側群細胞之間的平衡改變，並參與耐葯的形成。在MLL-AF9小鼠模型中，通過敲除外泌體成熟分泌過程中的關鍵蛋白VPS33B，證實了白血病乾細胞來源的外泌體通過自分泌的方式參與了其乾性的維持，靶向白血病細胞中的VPS33B蛋白可以明顯降低白血病細胞體外的集落形成能力並且延長小鼠的生存期。因此，靶向白血病細胞的外泌體分泌可能有助於解決白血病耐葯及複發的臨床問題。

二、白血病來源的

外泌體對微環境的重塑作用

造血微環境是調節和維持造血乾細胞（HSC）的局部組織環境，由多種細胞類型及細胞外成分構成。在急性髓系白血病（AML）環境下HSC受抑明顯，因而無法補充耗竭的造血祖細胞（HPC）。但受抑的HSC/HPC回到正常造血環境後，功能與對照組無明顯差異。這說明這些受抑的HSC/HPC脫離白血病環境後能完全恢復其重建造血和自我更新的功能。因此變化了的白血病微環境是導致正常造血被抑製的原因之一。近期的一項研究也表明，AML小鼠接受阿糖胞苷治療後，白血病負荷能夠顯著降低甚至於無法被檢測到，但是其血管結構的破壞及滲漏情況並沒有得到實質性的改善。這說明白血病微環境是一個被白血病細胞改造後的特殊環境，靶向白血病細胞本身並不能有效地恢復改造後的微環境使其恢復支持造血的功能。因此對於白血病微環境的研究不僅有助於靶向白血病乾細胞，也可能通過恢復受損的微環境同時促進正常細胞的再生。白血病來源的外泌體對骨髓微環境的重塑作用早有報導。Peter Kurre實驗室在2012年報導了白血病細胞來源的外泌體能將有功能的RNA傳遞到基質細胞中，使得共培養的OP9基質細胞分泌的生長因子發生改變，從而進一步影響了HPC系的增殖。而白血病細胞來源的外泌體對不同微環境細胞的重塑作用已有較多報導，以下按受體細胞類型分開闡述。

1．基質細胞或間充質乾細胞（MSC）：

CLL細胞分泌的外泌體作用於基質細胞，靶細胞接收了功能活躍的RNA及蛋白質後，轉錄特徵發生改變，並且增殖、遷移、分泌炎性細胞因子的能力增強，從而促進白血病的進展。類似的是，AML細胞來源的外泌體也能夠改造骨髓微環境，使其利於白血病細胞增殖。通過白血病細胞來源的外泌體處理正常小鼠，發現其MSC數目增多，但成骨分化受到阻滯。支持正常造血的相關因子如CXCL12、KITL及IGF1表達減少，從而降低了基質細胞對正常造血的支持作用。靶向外泌體分泌的關鍵蛋白Rab27a則能明顯減緩白血病的進展。急性淋巴細胞白血病細胞分泌的外泌體通過作用於骨髓基質細胞，改變其代謝狀態，使其傾向於糖酵解代謝方式以適應氧化應激，進而保護白血病細胞的生存及幫助白血病細胞抵抗化療損傷。

2．血管內皮細胞：

通過人臍靜脈內皮細胞系（HUVEC）與惡性膠質瘤U87細胞系共培養發現，腫瘤細胞能將DLL4整合入分泌的外泌體，這些DLL4蛋白能被骨髓內皮細胞接收並且整合到細胞上，從而造成內皮細胞Notch信號通路的相關受體的表達下調，影響了血管形成。CML細胞系LAMA84與HUVEC細胞系的共培養證實了CML細胞外泌體中miR-126的表達較細胞本底水準明顯提升，免疫熒遊標記證實了其能夠有效地進入內皮細胞，使得內皮細胞CXCL12和VCAM1表達明顯下降，從而負性調節LAMA84細胞的運動性與黏附性。K562細胞系來源的外泌體可以共培養的HUVEC的新生血管形成，這一作用可以被達沙替尼消除。表明了外泌體在內皮細胞內的功能發揮依賴於達沙替尼敏感的Src磷酸化及其下遊信號通路活化。體內研究也同樣表明了白血病細胞來源的外泌體促進了血管的生成。目前對於白血病細胞與骨髓血管內皮之間通過外泌體而進行的細胞之間相互調控報導較少，主要報導還是集中在白血病細胞外泌體與內皮細胞系共培養後的表型變化。對於原代內皮細胞及體內研究的限制是骨髓內皮細胞的分離及體外維持的困難，主要是因為骨髓中內皮細胞比例較低，分離時容易造成內皮細胞死亡；另外，骨髓原代細胞在體外培養時只能短暫地維持其組織特異性及血管生成能力，除非特異性活化AKT-mTOR信號通路。

3．成骨細胞（Osteoblast，OB）：

AML患者及小鼠模型中均可觀察到明顯的骨質下降。而通過藥理學方法恢復AML小鼠中OB的數量及功能可以減少腫瘤負荷並有效地延長小鼠生存期，這說明OB在白血病發病中有重要作用。而通過AML患者細胞或細胞繫上清來源的外泌體這一單一因素處理小鼠，也出現了骨質變薄、骨小梁減少等骨質丟失的現象，並且造血相關基因（IGF1、CXCL12、KITL和IL-7）及骨發育相關基因（OCN和Col1A1）在OB中表達下調，說明白血病細胞來源的外泌體能改造成骨微環境。

三、白血病來源的

外泌體對免疫系統的作用

通過對AML患者血清外泌體進行分離及分析，發現未治療的AML患者血清外泌體水準顯著高於對照，對外泌體蛋白進行分析發現其不僅高表達CD34、CD33和CD117等白細胞表面分子，還高表達TGF-β，患者血清來源的外泌體在體外能降低自然殺傷細胞的細胞毒作用，並且下調正常自然殺傷細胞的NKG2D的表達。而TGF-β的中和性抗體能夠消除細胞毒性作用的降低及NKG2D的表達下調。將治療前的白血病患者血漿來源的外泌體與NK-92細胞共培養，能夠降低其細胞殺傷能力，從而限制了過繼細胞治療的抗白血病細胞作用。這表明了白血病細胞來源的外泌體對機體的免疫總體而言起到了一個抑製的作用，從而幫助白血病細胞進行免疫逃逸。但白血病細胞來源的外泌體對其他類型免疫細胞的作用需要進一步探索，這可能有助於尋找增強白血病免疫治療反應性的潛在靶點。

四、白血病來源外泌體

對白血病環境中的正常造血影響

儘管已有大量的研究證實白血病細胞來源的外泌體改造了骨髓微環境，從而抑製了正常造血，但是白血病細胞來源的外泌體對正常造血的直接作用卻並未得到充分闡述。白血病患者來源的外泌體與正常臍血來源的HSC體外共作用7 d後，正常HSC數量增多，同時伴隨著miRNA-21和miRNA-29a表達升高，集落形成能力增強。近年的研究表明，白血病產生的外泌體除了使骨髓基質細胞表達SCF、CXCL12下調，從而抑製骨髓中正常HSC/HPC的功能；也通過不依賴於細胞直接接觸的方式作用於正常HSC/HPC，使其集落形成能力下降，丟失CXCR4與c-Kit表達，並且持續性地抑製包括c-Myb、Cebp-β和Hoxa-9等在內的多種造血相關轉錄因子。也有研究表明AML細胞通過外泌體攜帶的miR-150與miR-155，作用於正常的HSC/HPC，抑製了編碼c-Myb轉錄本的翻譯，從而影響HSC/HPC的增殖與分化。總之，白血病細胞來源的外泌體不僅通過自分泌作用進行自我強化，使其增加對治療的抵抗，還能通過作用於其他受體細胞，改變靶細胞的基因表達特徵或信號通路活化水準，從而改造微環境以適應白血病細胞生長，從而直接或間接地抑製正常造血。

五、微環境細胞來源的外泌體

在白血病中的作用

既往的研究認為，間充質乾細胞及內皮細胞等微環境細胞來源的外泌體對正常造血過程有支持作用。將骨髓MSC來源的外泌體與CLL細胞體外共作用24 h後，CLL細胞的自發凋亡減少，對多種藥物的抵抗增強。通過類似的處理，研究者發現人臍血MSC來源的外泌體對K562細胞系的增殖與凋亡無明顯影響，但能增強其對伊馬替尼的敏感性，增強其凋亡信號通路的活化，從而增強其對治療的反應性。基於同樣的策略而得出了不同的結論，可能的原因是MSC來源的外泌體在不同白血病細胞類型中可能發揮不同作用，也可能是用外泌體處理目的細胞的研究策略並不能很好地模擬體內實際的外泌體分泌水準。因此在進行外泌體體外研究時需要進行必要的劑量-效應關係分析。研究外泌體這一細胞間雙向通訊的媒介有助於我們發現以往缺失的信息，繪製出更為詳盡具體的白血病環境下細胞相互作用的圖譜，從而有利於更好地靶向白血病治療，減少耐葯與複發；同時有利於增強白血病環境下的正常造血，減少治療前及治療過程中患者可能出現的致命的三系減少情況，改善患者的生存及預後。

六、外泌體研究

在臨床研究中的意義

1．作為腫瘤生物標誌：

外泌體廣泛存在於多種體液、腫瘤中分泌水準較高、攜帶眾多的腫瘤細胞信息、取材相對無創等優勢使其成為了監測腫瘤的發生與疾病進展的可能指標。由於其在白血病中的免疫抑製作用，對外泌體的進一步研究也可能幫助預判對免疫治療的反應性，為治療方案的制定提供一定的依據。目前有研究認為外泌體相關分子可作為監測微小殘留病的指標，但這有待於從體液中分離外泌體方法的改善與分析指標標準的建立。

2．改造外泌體使其成為運送工具或靶向腫瘤細胞來源的外泌體：

由於外泌體直徑小，加之其對於受體細胞的選擇存在一定的偏向，將工程改造後的外泌體作為運送介質可以達到高效、特異地殺傷惡性細胞的目的。通過改造MSC來源的外泌體使其攜帶靶向K-RAS突變的shRNA，能夠在多種胰腺癌動物模型中減慢腫瘤進展並且顯著改善生存。如前所述，白血病細胞分泌外泌體後以自分泌的方式進行自我強化，並改造微環境，從而直接或間接地抑製正常造血。因此靶向腫瘤細胞來源的外泌體本身可作為一個削弱腫瘤細胞，扶持正常造血的靶點。

七、總結及展望

外泌體在白血病機制研究、臨床監測及治療上有著重要的意義，但我們也不難看出目前外泌體研究的諸多製約因素。如Thery教授所說，我們現在對於外泌體的認識，就相當於我們20世紀50年代對於免疫的認識。我們僅知道白細胞中某些細胞有殺傷細胞或產生抗體的功能，但並不能捕獲及識別B細胞或T細胞。首先在於外泌體"表型"的界定上。儘管目前有多種方式可進行外泌體的分離與純化，但是不論是哪種方式都不能獲取到絕對純度的外泌體，因此2014年發表了外泌體鑒定的最低要求以及報告規範。

而在功能研究上，現階段運用最為廣泛的研究手段為提純外泌體後將其作為獨立因素進行處理，這樣的研究方式本身存在著較大的局限。首先我們可以看到在體外運用外泌體來處理目的細胞時的濃度是遠高於體內水準的，因此在進行外泌體共作用研究時，劑量-效應關係是非常必要的；而體內研究時，從各種體液分離到的外泌體是體內多種細胞來源的混合，難以判斷其來源，目前的驗證方式多是基於親脂性染料及熒光蛋白的追蹤，更為深層及長時效的影像追蹤將有助於我們在體內捕獲外泌體的作用及其方式。近年的一些研究也給了我們一些啟示：基於轉基因的小鼠模型有助於彌補這方面的不足，通過敲除外泌體產生及分泌的關鍵蛋白質，再進行功能研究可以明確地反映特定細胞來源的外泌體在體內的功能，並且通過不同實驗條件的組合能進一步探究其作用方式的時空特異性。