領募-抑製AKT/mTOR通路可以增強索拉非尼在甲狀腺癌中的作用

分化型甲狀腺癌（DTC）佔所有甲狀腺腫瘤的95%左右。放射性碘治療作為其重要治療措施，目前在臨床上應用廣泛，但是在發生轉移的情況下，超過半數的患者會發展成為放射性碘難治性DTC。索拉非尼是一種多激酶抑製劑，已被批準用於治療放射性碘難治的進展期DTC。然而，此類患者的無進展生存期（PFS）仍然較短，且多數患者最終會出現耐葯。因此，探索新的治療方法就顯得尤為重要。

DTC發生與RAS基因突變相關：RAS基因突變會激活MAPK通路及PI3K/AKT/mTOR通路，並且在DTC中可能會優先激活PI3K/AKT/mTOR通路。這兩種通路激活都會導致甲狀腺癌惡性程度增高，而且會導致患者對抗腫瘤治療耐葯。已有臨床研究證實，AKT磷酸化水準更低的患者對索拉非尼的應答率更高，提示索拉非尼治療的預後與PI3K/AKT/mTOR通路密切相關。然而，其中的關係和具體機制尚不明確。

因此，來自浙江省腫瘤醫院的研究團隊通過設計細胞實驗對索拉非尼與PI3K/AKT/mTOR通路之間的關係及可能機制展開了探索，以期為DTC的治療提供新的思路。

實驗設計

選取細胞係為人甲狀腺癌細胞系8505C和FTC133，用不同濃度索拉非尼作用不同時間，同時應用siRNA干擾技術及抑製劑BEZ235（PI3K和mTOR共同的抑製劑）來抑製AKT通路，觀察各組合效果。

干擾效率用AKT轉錄（mRNA水準，通過qRT-PCR檢測）及蛋白翻譯（磷酸化的AKT、p70s6k，用western blot檢測）水準來驗證。p70s6k為mTOR重要下遊分子。通路中重要分子（AKT、p70s6k或ERK）的磷酸化水準代表通路激活情況，本研究中，磷酸化水準越高代表激活越明顯。

用CCK8試劑盒來檢測細胞增殖情況和存活率，用膜聯蛋白v（Annexin-V）和碘化丙啶染色，再用流式細胞儀來檢測細胞凋亡。

實驗結果

1 、索拉非尼可以有效抑製甲狀腺癌細胞增殖，促進甲狀腺癌細胞凋亡

在8505C和FTC133細胞系中用不同濃度的索拉非尼作用不同時間，可以發現，在劑量高於5uM時，索拉非尼可以有效抑製甲狀腺癌細胞增殖，這種抑製作用呈現出時間及劑量依賴趨勢。同時，隨著索拉非尼劑量增加，作用72小時後8505C和FTC133細胞的凋亡比例均上升，在10uM時分別鋼彈22.9%和56.7%。

圖1. 不同濃度索拉非尼作用不同時間對兩種甲狀腺癌細胞系存活率及凋亡的影響

2、索拉非尼可以抑製MAPK及AKT/mTOR通路

在8505C和FTC133細胞系中分別用2.5、5和10uM索拉非尼作用24小時，ERK（MAPK通路中重要分子）表達水準無明顯變化，但是磷酸化的ERK在10uM條件下與對照組相比顯著下降。類似地，用10uM索拉非尼作用24小時，可以顯著抑製AKT和其重要下遊分子p70s6k的磷酸化。

圖2. 不同濃度索拉非尼作用24小時後，兩種甲狀腺癌細胞系（左8505C，右FTC133，下同）中MAPK及AKT/mTOR通路的激活情況

3、抑製AKT通路可以促進甲狀腺癌細胞凋亡，同時有助於索拉非尼發揮作用

研究者通過siRNA干擾技術，使得AKT轉錄（mRNA水準）顯著下降，磷酸化的AKT和p70s6k表達水準也顯著下降。如圖中所示，AKT-siRNA2的干擾最為有效。在此基礎上加入索拉非尼，可以更加有效地降低這兩種蛋白的磷酸化水準。

此外，通過檢測細胞存活率及凋亡情況，可以發現在兩種細胞系中，抑製AKT通路同時應用索拉非尼可以顯著促進細胞凋亡，降低細胞存活率，其效果比單用索拉非尼或單純抑製AKT通路更勝一籌。

圖3. 用siRNA干擾AKT通路情況下索拉非尼對兩種甲狀腺癌細胞系存活及凋亡的影響

4、索拉非尼聯合應用BEZ235可以顯著提高抗甲狀腺癌治療效果

BEZ235作為一種PI3K和mTOR抑製劑，可以有效抑製AKT通路。並且，實驗結果證實，BEZ235與索拉非尼合用可以顯著促進兩種甲狀腺癌細胞凋亡，療效顯著高於單用BEZ235和單用索拉非尼。

圖4. AKT通路抑製劑BEZ235的效果及與索拉非尼聯用對甲狀腺癌細胞系凋亡的影響

作者觀點

由於缺少有效的治療方案，放射性碘難治的進展期DTC預後較差。索拉非尼作為重要治療藥物，其有效性受到耐葯的限制，且具體耐葯機制尚不明確。

本研究提示索拉非尼可同時抑製MAPK和AKT/mTOR通路的活性，誘導甲狀腺癌細胞凋亡、抑製其增殖過程；而聯合應用BEZ235與索拉非尼可更有效的促進癌細胞凋亡並抑製其增殖，提示聯合AKT/mTOR抑製劑或可作為索拉非尼的有效輔助手段。但具體的臨床效果及藥物可能的毒副作用仍需進一步研究