更快，更便宜，更好：一種合成DNA的新方法

在快速增長的合成生物學領域中，生物體可以被設計用於分解塑料和製造生物燃料和藥物，定製DNA序列的生產是科學發現的基本工具。然而，DNA合成過程40多年來基本保持不變，可能會很慢且不可靠。

現在能夠解決生物學研究中的關鍵瓶頸的是，位於美國勞倫斯伯克利國家實驗室（Berkeley Lab）的能源部聯合生物能源研究所（JBEI）的研究人員宣布他們開創了一種通過創意合成DNA序列的新方法使用更快，更便宜，更準確的酶。由JBEI研究生Sebastian Palluk和Daniel Arlow長官的這項發現在Nature Biotechnology的一篇名為「De novo DNA Synthesis Using Polymerase-Nucleotide Conjugates」的論文中發表。

JBEI首席執行官Jay Keasling說，「DNA合成是我們建立生物學時所做的一切的核心，」該論文通訊作者Jay Keasling也是伯克利實驗室高級教授科學家。「自從Marvin Caruthers在近40年前發明了固相DNA合成技術以來，Sebastian和Dan創造了我認為合成DNA最好的方法，這對於科學來說意味著我們可以更便宜地設計生物學，而且以新的方式 - 比過去我們能做到的要好。「

Caruthers過程使用有機化學工具逐個連接DNA構建模塊，並已成為世界各地DNA合成公司和實驗室使用的標準方法。然而，它有一些缺點，主要是它在200個鹼基處達到極限，部分是由於副反應比合成過程中可能發生的副反應，並且它產生危險廢物。對於研究人員來說，即使1,000個鹼基被認為是一個小基因，所以為了製作更長的序列，使用容易失敗並且不能製作特定序列的過程將較短的序列拚接在一起。

在線購買您的基因

DNA序列由四種化學鹼基組成，以字母A，C，T和G表示。研究人員經常使用數千個鹼基長度的基因。為了獲得它們，他們需要從現有的生物體中分離基因，或者他們可以從公司訂購基因。

「你直接將序列粘貼到網站中，然後等待兩周，」Arlow說。「假設你購買了10個基因，也許有9個基因會按時交付給你，另外，如果你想測試1000個基因，每個基因300美元，成本加起來非常快。

Palluk和Arlow的動機是為了解決這個問題，因為作為學生，他們花了許多冗長乏味的時間為他們的實驗製作DNA序列，因為他們寧願做實際的實驗。

「DNA是一個巨大的生物分子，」Palluk說。「大自然使用酶製造生物分子，而這些酶在處理DNA和複製DNA方面非常出色，通常我們的有機化學過程不會接近天然酶提供的精確度。」

外箱思考

使用酶來製造DNA的想法並不新鮮 - 科學家們幾十年來一直試圖找到一種方法來做到這一點，但沒有成功。選擇的酶稱為TdT（末端脫氧核苷酸轉移酶），它在脊椎動物的免疫系統中被發現，並且是自然界中從頭開始寫新DNA而不是複製DNA的少數幾種酶之一。更重要的是，它速度很快，能夠每分鐘增加200個基地。

為了利用TdT合成所需序列，關鍵要求是使其隻添加一個核苷酸或DNA構建模塊，然後在繼續添加相同的核苷酸之前停止。所有以前的提議都設想使用經特殊封閉基團修飾的核苷酸來防止多次添加。然而，問題在於酶的催化位點不足以接受具有連接的封閉基團的核苷酸。「人們基本上試圖通過變異來為這個阻塞組騰出太空，從而在酶中」挖空洞「，」Arlow說。「這很棘手，因為你需要為它騰出太空，但也沒有搞砸酶的活性。」

Palluk和Arlow想出了一個不同的方法。「而不是試圖挖掘酶的一個洞，我們所做的是通過一個可裂解的接頭連接每個TdT酶的一個核苷酸，」Arlow說。「通過這種方式，在用連接的核苷酸延伸DNA分子後，該酶沒有其他可用的核苷酸可以添加，因此它停止了。這種方法的一個關鍵優勢是DNA的骨架 - 實際上化學反應的部分反應 - 就像天然DNA一樣，所以我們可以嘗試從酶中獲得全速。「

一旦核苷酸被添加到DNA分子中，酶被切割掉。然後循環可以再次開始，下一個核苷酸與另一個TdT酶連接。

凱斯林認為這種方法聰明且違反直覺。「他們並沒有重複使用酶作為催化劑，而是說，"嘿，我們可以非常便宜地製造酶，讓我們把它扔掉。所以酶成為一種試劑而不是催化劑，「他說。「那種想法讓他們做了與文獻中提出的非常不同的東西 - 我認為 - 完成了一些非常重要的事情。」

他們通過手工製作10個鹼基的DNA序列來展示他們的方法。毫不奇怪，這兩名學生最初遭到懷疑。「即使我們有初步的結果，人們也會說，"沒有意義，看起來不正確，這不是你如何使用酶，"」Palluk回憶說。

他們仍然有很多工作要做，以優化他們的方法，但他們有理由相信，他們最終能夠在化學方法的速度下，一次性製造1000個鹼基的基因。

「經過幾十年的優化和微調之後，傳統方法現在每步的產率通常可達到約99.5％，我們的概念驗證合成每步產率為98％，所以目前還沒有達到標準。這是一個有前途的起點，「Palluk說。「我們認為我們很快就會迎頭趕上，相信我們可以推動該系統遠遠超出目前化學合成的局限性。」

「我們的夢想是在一夜之間創造一個基因，」Arlow說。「對於試圖持續生物製造有用產品，新藥物或更環保農業工具的公司，以及JBEI和DOE，我們試圖從生物質生產燃料和化學品的公司來說，DNA合成是關鍵的一步。那可能會大大加速整個發現過程。「