T細胞工程的突破避免了基因編輯中病毒的需求

通過更快，更便宜，更精確的技術，作者們表示它正在進行新的細胞治療

在一項對研究，醫學和工業產生重大影響的成就中，加州大學舊金山分校的科學家們已經對人體免疫細胞進行了遺傳重編程，稱為T細胞而不使用病毒插入DNA。研究人員表示，他們希望他們的技術 - 採用CRISPR基因編輯技術的快速，通用和經濟的方法 - 在新興的細胞治療領域被廣泛採用，加速開發新的和更安全的癌症治療方法，自身免疫，和其他疾病，包括罕見的遺傳性疾病。

2018年7月11日出版的「 自然」雜誌中描述的新方法提供了一種強大的分子「切割和粘貼」系統，用於重寫人類T細胞中的基因組序列。它依賴於電穿孔，這是一種將電場施加到細胞上以使其膜暫時更具滲透性的過程。在一年內試驗了數千個變數之後，加州大學舊金山分校的研究人員發現，當某些數量的T細胞，DNA和CRISPR「剪刀」混合在一起然後暴露在適當的電場中時，T細胞將會在這些元件中，精確地將特定的基因序列整合到基因組中編程的CRISPR編程位點。

「這是一種快速，靈活的方法，可用於改變，增強和重新編程T細胞，因此我們可以為他們提供我們想要的特異性，以消除癌症，識別感染，或者遏製自身免疫性疾病中出現的過度免疫反應，」加州大學舊金山分校的Alex Marson，醫學博士，博士，微生物學和免疫學副教授，加州大學舊金山分校海倫迪勒家庭綜合癌症中心成員，以及新研究的高級作者。「現在我們已經參加了所有這些方面的比賽。」

但同樣重要的是新技術的速度和易用性，Marson，也是創新基因組學研究所的生物醫學科學主任說，這種方法可以將大量的DNA插入到T細胞中，這可以賦予細胞具有強大的新屬性。Marson實驗室的成員使用電穿孔和CRISPR將一些遺傳物質插入到T細胞中取得了一些成功，但直到現在，許多研究人員多次嘗試將長序列的DNA置於T細胞中導致細胞死亡，導致大多數細胞死亡。相信大的DNA序列對T細胞過度毒性。

為了證明新方法的多功能性和功效，研究人員用它來修復具有罕見遺傳形式的自身免疫的兒童T細胞中引起疾病的基因突變，並且還創建了定製的T細胞以尋找和殺死人類黑色素瘤細胞。

病毒通過細胞膜注射自己的遺傳物質引起感染，自20世紀70年代以來，科學家們利用這種能力，剝奪感染性病毒的病毒，利用所產生的「病毒載體」將DNA轉運到細胞中進行研究，基因治療，並在最近公布的例子，用於創建用於癌症免疫療法的CAR-T細胞。

用病毒工程改造的T細胞現在被美國食品和藥物管理局批準用於對抗某些類型的白血病和淋巴瘤。但是創建病毒載體是一項艱苦而昂貴的過程，臨床級載體的短缺導致基因療法和基於細胞的療法的製造瓶頸。即使可用，病毒載體仍遠非理想，因為它們將基因隨意插入細胞基因組中，這可能損害現有的健康基因或留下由監管機制無法控制的新引入的基因，從而確保細胞正常運作。這些可能導致嚴重副作用的限制引起基因治療和細胞療法如基於CAR-T的免疫療法的關注。

「已經有三十年的工作嘗試將新基因導入T細胞，」第一作者Theo Roth說，他是一名在加州大學舊金山分校醫學科學家培訓項目中攻讀博士和博士學位的學生，他在Marson實驗室設計並長官了這項新研究。「現在不再需要六個或七個人在實驗室中使用病毒來設計T細胞，如果我們開始看到數百個實驗室設計這些細胞而不是少數，並且越來越多地工作複雜的DNA序列，我們將嘗試更多的可能性，它將顯著加速未來幾代細胞療法的發展。「

經過近一年的反覆試驗，Roth確定了T細胞群，DNA量和CRISPR豐度的比例，結合使用適當參數傳遞的電場，可以有效，準確地編輯T細胞。 "基因組。

為了證實這些發現，羅斯指示CRISPR用綠色熒光蛋白（GFP）標記一系列不同的T細胞蛋白，結果具有高度特異性，具有非常低水準的「脫靶」效應：每個亞細胞結構Roth的CRISPR模板設計用GFP標記 - 而沒有其他 - 在顯微鏡下發出綠光。

然後，在設計用作新技術治療前景的原理驗證的補充實驗中，Roth，Marson及其同事展示了它如何潛在地用於整合T細胞對抗自身免疫性疾病或癌症。

在第一個例子中，Roth及其同事使用耶魯大學醫學院醫學博士Kevan Herold提供給Marson實驗室的T細胞。這些細胞來自三個患有罕見，嚴重的自身免疫性疾病的兄弟姐妹，迄今為止一直對治療有抵抗力。基因組測序表明，這些兒童的T細胞攜帶一種名為IL2RA的基因突變。該基因包含對調節性T細胞或Tregs發育所必需的細胞表面受體的說明，其可以控制其他免疫細胞並防止自身免疫。

利用非病毒CRISPR技術，UCSF團隊能夠快速修復兒童T細胞中的IL2RA缺陷，並恢復受突變影響的細胞信號。在CAR-T治療中，已經從體內移除的T細胞被設計為增強其抗癌能力，然後返回身體以靶向腫瘤。研究人員希望類似的方法可以有效治療Tregs出現故障的自身免疫性疾病，例如在三名患有IL2RA突變的兒童中看到的疾病。

在與加州大學洛杉磯分校Parker癌症免疫療法研究所的Cristina Puig-Saus博士和Antoni Ribas博士合作進行的第二組實驗中，科學家們完全取代了正常人類T細胞群中的天然T細胞受體。新的受體，專門設計用於尋找人類黑色素瘤細胞的特定亞型。T細胞受體是細胞用於檢測疾病或感染的感測器，並且在實驗室培養皿中，工程細胞有效地歸巢於靶向黑素瘤細胞而忽略其他細胞，表現出精確癌症醫學的主要目標的那種特異性。

在不使用病毒的情況下，研究人員能夠生成大量經過重新編程的CRISPR工程細胞，以展示新的T細胞受體。當轉移到植入人黑素瘤腫瘤的小鼠中時，工程化的人T細胞進入腫瘤部位並顯示出抗癌活性。

「這種替代T細胞受體的策略可以推廣到任何T細胞受體，」Marson說，他也是加州大學舊金山分校Parker癌症免疫治療研究所和Chan Zuckerberg Biohub研究員的成員。「通過這種新技術，我們可以剪切並粘貼到指定的位置，重寫基因組序列中的特定頁面。」

Roth說，因為新技術可以在一周多一點的時間內創建可行的定製T細胞系，它已經改變了Marson實驗室的研究環境。由於病毒載體帶來的障礙，以前被認為過於困難或昂貴的實驗的想法現在已經成熟，可供調查。「我們將研究20個"瘋狂"的想法，」Roth說，「因為我們可以非常快速地創建CRISPR模板，一旦我們有了模板，我們就可以將它放入T細胞並快速生長。」

Marson將新方法的成功歸功於羅斯的「絕對堅持」，面對人們普遍認為病毒載體是必需的，並且T細胞只能容忍小片DNA。「Theo確信，如果我們能夠找到合適的條件，我們就可以克服這些明顯的局限性，並且他付出了巨大的努力來測試數千種不同的條件：CRISPR與DNA的比例;培養細胞的不同方式;不同的電流。通過優化每個參數並將最佳條件放在一起，他能夠看到這個驚人的結果。「