作為當下最受關注的生物技術之一，CRISPR 一直被認為有望未來在遺傳疾病、癌症或者是 HIV/AIDS 的治療上大放異彩。
現在，新的研究表明，CRISPR 可通過非病毒載體改進現有的細胞療法。加州大學舊金山分校（UCSF）的科學家們成功使用非病毒載體在人類免疫細胞 T 細胞中插入了 DNA 片段，這不論在研究界，還是醫學或者工業界，都開創了先河。
細胞療法是通過基因編輯細胞，從而達到治療疾病的目的。研究者們希望他們的這項快速、多功能以及經濟的 CRISPR 基因編輯技術能夠在基因和細胞治療領域得到廣泛應用，從而促進對腫瘤、自身免疫病以及其他疾病的新型安全療法的開發。這項技術刊登於 2018 年 7 月 11 日的《自然》。
圖丨此次的論文
非病毒載體終於出場！
從人類免疫細胞 T 細胞入手治療癌症已經不是新的思路。
2017 年，製藥巨頭諾華和吉利德的細胞療法 Kymriah 與 Yescarta 就被美國食品和藥品管理局（FDA）批準，它們的治療過程就包括提取免疫性T細胞，在實驗室中對它們進行重新設計，然後再將它們放入患者體內。這樣的療法對於某些難以治療的癌症來說，其治癒結果可能非常驚人。
不過，在這個方法被報導以前，上述療法中，科學家們一般使用病毒載體向 T 細胞導入外源基因。
病毒載體的原理是，病毒可以感染細胞並將自身的基因組注射到細胞膜內。從上世紀 70 年代開始，科學家們就開發了這種載體技術，將外源基因導入到想要編輯的細胞中，應用的領域包括基礎研究、基因治療以及最近用於腫瘤免疫治療的 CAR-T。
但是開發病毒載體較為困難，而且昂貴，並且能夠利用的臨床級別的病毒載體較少。不過，即使上述缺陷得到解決，病毒載體也並不是完美的，因為它們插入基因組的方式較為隨意，這會導致細胞內正常基因組被破壞，或者是將外源基因插入到細胞調控機制不覆蓋的地方，這些都會引起嚴重的副作用。
「為了將新基因導入到 T 細胞中，科學家們已經努力了將近三十年了，」這篇文章的第一作者 Theo Roth 說，他就讀於 UCSF 醫學研究訓練項目（Medical Scientist Training Program），「有了我們的這個新技術，一個實驗室六七位研究人員再也不用為了編輯 T 細胞一起改裝病毒載體。而且如果數百個實驗室可以開始使用這項新技術來編輯細胞，或者是攻克如何將複雜的長片段 DNA 導入細胞，這顯然會加快細胞療法的進程。」
圖丨Theo Roth
更快更經濟，編輯 T 細胞只需約一周時間
其中的關鍵技術主要依賴於「電穿孔（electroporation）」。電穿孔是利用電場刺激使得細胞膜通透性暫時增加的方法。研究者們發現，將適當的電場施加於一定比例 T 細胞、外源 DNA 以及魔剪 CRISPR 混合系統中，T 細胞就會將外源 DNA 和 CRISPR 吸收，接著魔剪 CRISPR 就會發揮作用，在某個特定的位置進行基因編輯。
但這個技術並未一開始就奏效。歷經幾乎一年數千次的試驗和失敗，Roth 和他的團隊成員才找到了最適合的 T 細胞、DNA 數量以及 CRISPR 的比例，然後施加以適當的電場，就可以成功有效地編輯 T 細胞的基因組。
為了證實他的發現，Roth 利用 CRISPR 技術在 T 細胞中熒光（GFP）標記了一系列不同的蛋白，結果顯示其可以特異性標記蛋白，並且脫靶效應較低——顯微鏡下只能看到特異性標記的亞細胞結構呈現 GFP 熒光綠色。
圖丨研究人員將特定 CRISPR 導入 T 細胞中，這些 CRISPR 在 T 細胞內使得綠色熒光蛋白特異性表達於某些結構或區域
接著，為了證明這個方法能夠實現治療（多功能性和有效程度）的目的，Roth、 Marson 以及他們的同事們在自身免疫病和腫瘤中試驗了用這種方法編輯後的 T 細胞。
在第一個試驗中，未編輯的 T 細胞由耶魯大學醫學院的 Kevan Herold 醫生所提供。這些 T 細胞是從患有一種罕見且嚴重的自身免疫病的三個兄弟姐妹體內分離的。這種自身免疫病非常頑固，對目前治療自身免疫病的療法都具有抗性。測序表明這些兒童體內的 T 細胞具有 IL2RA 基因突變。這個基因對於調節性 T 細胞（regulatory T cells, or Tregs）的某個膜蛋白受體具有重要的調控作用。調節性 T 細胞可以調控免疫細胞，是一類控制體內自身免疫反應性的 T 細胞亞群。
利用這項非病毒載體的 CRISPR 技術，UCSF 研究組很快就修復了這些 T 細胞 IL2RA 突變，並且還恢復了這個基因突變所導致的信號通路異常。研究者們採用類似 CAR-T 療法的方法——即將 T 細胞從體內分離後進行編輯，然後再回輸到體內——來治療調節性 T 細胞缺陷的自身免疫病。
圖丨Alex Marson。Spotlight Therapeutics 的共創始人，並且是 Juno Therapeutics 和 PACT Pharma 的顧問。Marson 實驗室一部分基金來自 Juno, Epinomics，Sanofi 以及 Gilead Sciences
在第二個試驗中，UCSF 研究組和 UCSD Parker 癌症免疫療法研究院的 Cristina Puig-Saus 博士、Antoni Ribas 醫生進行了合作。在這個試驗中，科學家們成功地將體內分離的正常 T 細胞的受體用新受體替換，這個新受體可以識別黑色素瘤的某個特定的亞型。T 細胞的受體是 T 細胞用來識別病態或者被感染細胞的感受器。體外實驗表明，改裝後的 T 細胞可以特異性識別黑色素瘤細胞，而不攻擊其他細胞。
即使不用病毒載體，研究者們也成功生產出了大量 CRISPR 重新編組過的能夠表達新受體的 T 細胞。他們還證明當將這些 T 細胞轉入到種植了人類黑色素瘤的小鼠時，它們被募集到了腫瘤區域，並且展示出了抗腫瘤效應。
「這種技術可以應用於替換任何 T 細胞受體，」Marson 說，他還是 UCSF Parker 癌症免疫療法研究院和 Chan Zuckerberg Biohub 的一位成員，「有了這項技術，我們可以在任何特定位置剪切和插入基因。」
有望改變整個產業
Roth 特別提到，由於這項技術使得編輯 T 細胞只需要一周多一點的時間。以前由於病毒載體而覺得過於困難或過於昂貴的實驗想法，現在都可以嘗試著用這個新方法去實現。這就意味著，生物技術研發很可能因此迎來新的「物種大爆發」。
「我們會探索 20 個瘋狂想法，」Roth 說，「因為我們可以快速生產出 CRISPR 模板。而且一旦我們有了模板，我們就可以將它導入到 T 細胞中。」
「這是一個非常快速、靈活的方法，可以改變、增強或者重新編碼 T 細胞。這樣，我們就可以把 T 細胞變成我們想要的樣子，從而可以在對抗腫瘤、感染、自身免疫病中發揮重要作用。」 UCSF 的 Alex Marson 如此說道。他是 UCSF 微生物學和免疫學副教授、海倫迪勒家庭綜合癌症研究中心的成員，也是這個研究的通訊作者，「這些都是從未探索過的。」
在面對科學屆公認病毒載體是必須的、只有少數 DNA 可以導入到 T 細胞的時候，Marson 和 Roth 表現出的超人的毅力顯得難能可貴，最終推動了新方法的誕生。
研究人員也表示：「當我們能夠找到適當的條件來克服這些困難的時候，我們就證明了我們的理論。Roth 付出了很多，費盡心思進行了數千種不同的試驗，尋找 CRISPR 和 DNA 的比例、培養細胞的最佳方法、電場電流的大小等等。正是他對每一個參數都嚴格試驗從而找到最佳條件，我們才收穫了這個震驚的結果。」
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