【繼教園地】循環腫瘤DNA甲基化在非小細胞肺癌中的研究進展

肺癌是中國也是全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）約佔85%。肺癌患者的5年生存率僅為15.6%，而不同腫瘤TNM分期（the tumor-node-metastasis classification）的患者預後存在顯著差異，原位癌的治癒率接近100%，而Ⅰ~Ⅳ期患者的5年生存率分別為43%~73%、25%~46%、7%~24%和2%~13%，超過70%的患者確診時已處於晚期階段。早期診斷、早期治療是改善肺癌預後及降低死亡率的關鍵。目前肺癌診斷主要依賴低劑量CT和組織活檢。2011年《新英格蘭醫學雜誌》發表的低劑量CT篩查肺癌的大規模隨機對照研究結果顯示，高危人群的低劑量CT較普通X線X光可使肺癌死亡率降低20%（P=0.004），但假陽性率鋼彈96%。而肺組織活檢為侵入性操作，某些患者不適合進行，如嚴重肺氣腫、出血性疾病及嚴重凝血功能障礙等；腫瘤異質性使局灶取樣結果存在偏差，不能反映腫瘤完整的遺傳資訊等。因此，尋找特異度及敏感度高的生物標誌物對肺癌的早期診斷及精準治療有重要意義。

液體活檢在肺癌的診斷與科研中發揮著越來越重要的作用，其中循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）來源於腫瘤細胞，不僅可展現腫瘤基因全貌，也可間接反映腫瘤進展情況、異質性及侵襲能力。ctDNA甲基化是NSCLC診斷、治療及預後評估過程中的一種有潛力的生物標誌物，可實時跟蹤腫瘤的動態變化。本文將ctDNA甲基化在肺癌中的研究進展綜述如下。

ctDNA甲基化

1947年Mandel首次發現人體血液中存在循環遊離DNA（circulating free DNA，cfDNA）。由於血液中cfDNA水準較低且難以檢測，因此沒有得到足夠的重視。1997年Leon等首次用放射免疫分析法證實腫瘤患者cfDNA含量明顯高於健康人，且cfDNA增高或持續高水準可能是預後不良的標誌。1989年Stroun等發現腫瘤患者血漿和血清中的cfDNA有與腫瘤基因改變相同的DNA片段，並證實其來源於腫瘤細胞，命名為ctDNA。

ctDNA包含與腫瘤相同的特異性基因突變，且在某些富含GC的片段攜帶相同的獨特表觀遺傳標誌，即DNA甲基化。DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases, DNMT）介導下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基基團添加到DNA分子的鹼基上,以胞嘧啶-鳥嘌呤（cytosine phosphate guanine，CpG）二聯核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子和甲基間的共價結合最為常見。目前發現，在哺乳動物細胞中有活性的DNMT主要分為3種：DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，其中DNMT1主要識別半甲基化DNA，維持DNA甲基化狀態；DNMT3A和DNMT3B則催化新的DNA甲基化位點形成。CpG島位於轉錄調控區附近，正常細胞內啟動子區的CpG島呈非甲基化狀態，而70%~90%散在分布的CpG位點發生甲基化。發生腫瘤時常伴隨抑癌基因CpG島異常高甲基化，DNA甲基化後，甲基基團直接干擾轉錄因子（SP1、E2F）、核因子-κB等與啟動子結合，同時甲基化的CpG結合蛋白與組蛋白去乙醯基轉移酶（histone deacetylase, HDAC）相互作用，修飾染色質，使染色質緊縮，從而引起基因轉錄沉默，抑癌基因、細胞周期調節基因及凋亡基因等表達降低或不表達，促進腫瘤的形成。抑癌基因啟動子甲基化在肺癌的發生、發展中起著至關重要的作用。與基因突變相比，突變的序列可能分布在較廣的區域，而DNA甲基化往往發生在CpG島的DNA特定區域，且一致性好，即使提取的DNA濃度較低時，也可通過PCR實現擴增。隨著液體活檢技術的發展，ctDNA甲基化有望成為檢測肺癌的無創性血液學生物標誌物。

ctDNA甲基化的檢測方法

ctDNA在血液中的濃度非常低，處於高度碎裂狀態，且由於脫氧核糖核酸酶的作用，ctDNA在血液中的穩定性差，使其分離和富集面臨巨大挑戰。研究結果表明，血清中ctDNA濃度是血漿中的3~24倍，但特異的ctDNA會被凝血過程中白細胞釋放的非特異DNA汙染而稀釋,因此，血漿代替血清可提高ctDNA的收集效率。

目前DNA甲基化的檢測方法分為三類：（1）甲基化含量：高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）或高效毛細管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE）；（2）甲基化分型：根據聚合酶鏈式反應設計的引物分為甲基化非依賴性PCR（methylation-independent PCR，MIP）引物和甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP）引物，可分為MSP、熒光定量PCR（如TaqMan熒光探針、SYBR熒光染料法）、MSP和熒光定量PCR結合的熒光水解探針法或稱定量MSP、亞硫酸氫鈉轉化和直接測序法、甲基化敏感性限制性內切酶（methylation-sensitive restriction endonuclease, MS-RE)-PCR/Southern印跡法（正確）及甲基化敏感性解鏈曲線分析（methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA）等；（3）甲基化模式和甲基化譜分析：甲基化基因晶元（如高通量測序和飛行質譜法）、限制性標記基因組掃描（restriction landmark genomic scanning, RLGS）、甲基化間區位點擴增技術（amplification of inter-methylated sites, AIMS）等。目前研究中最常用的方法是甲基化特異性PCR。

ctDNA甲基化與NSCLC診斷

目前與NSCLC相關的高甲基化基因位點超過80種，如APC、RARβ、RARβ2、RASSF1A、CDH13、DCC、TMEFE2及SHOX2等。Kontic等分別檢測65例NSCLC患者的腫瘤組織、正常肺組織及配對的外周血ctDNA的5個基因（RASSF1A、CDH13、MGMT、ESR1和DAPK）的CpG甲基化，結果顯示腫瘤組織中CDH13、RASSF1A和DAPK基因的甲基化顯著高於正常肺組織，但血液中的DNA甲基化水準未升高，但該研究缺乏健康對照組。CDKN24基因（又稱p16）高度甲基化是外周血中潛在的診斷早期肺癌的生物標誌物。Bearzatto等關於CDKN24的早期研究中僅納入35例NSCLC及15名健康對照組，健康對照組數量非常少。後續研究則增加健康對照組樣本量，Zhang等發現，NSCLC腫瘤標本中p16甲基化率為25.4%（20/78例），而配對癌旁正常組織僅為6.4%（5/78例）；Ⅰ、Ⅱ期NSCLC患者和無癌對照組血漿標本中的甲基化率分別為22.7%（25/110例）和8.0%（4/50例）。Belinsky等發現，9%（7/74例）的非吸煙健康女性中血漿DNA中檢測到p16甲基化，而肺癌存活者中p16甲基化陽性率為25%（11/44例）。

ctDNA甲基化

與NSCLC治療方案選擇

ctDNA甲基化可預測NSCLC患者的治療反應，指導治療方案的選擇。RASSF1A啟動子甲基化是Ⅰ~Ⅱ期NSCLC患者接受紫杉醇-卡鉑新輔助化療方案後無疾病生存期（disease-free survival，DFS）較長，非甲基化組較甲基化組患者的DFS增加了4倍；RASSF1A甲基化組與吉西他濱-順鉑組相比，前者中紫杉醇-卡鉑治療患者的DFS可延長24個月（HR分別為1.32和0.55）。

晚期NSCLC患者以鉑類藥物為基礎的兩葯聯合化療是標準一線治療方案，但有效率僅為25%~30%。14-3-3σ基因甲基化是NSCLC患者接受鉑類化療的一個新的獨立預後因素，且可在ctDNA中方便、可靠地檢測到，一項多中心前瞻性研究結果表明，14-3-3σ甲基化陽性患者的中位生存期明顯延長（P=0.001）。除14-3-3σ基因外，基於順鉑化療後，ctDNA中APC或RASSF1A甲基化水準升高的肺腺癌患者預後更好。

晚期NSCLC的二線治療結果顯示，表皮生長因子受體抗體-酪氨酸激抑製劑（EGFR-TKI）與標準化療相比，患者總生存期較長。Salazar等分析了179例根據ERCC1 mRNA水準採用順鉑進行化療的Ⅳ期NSCLC患者接受二線化療或EGFR-TKI治療的療效，發現ctDNA CHFR非甲基化可預測二線EGFR-TKI治療較長的生存期，甲基化組化療與二線EGFR-TKI的總生存期分別為12和14個月（P=0.21）；非甲基化組分別為11和21個月（P=0.001）。ctDNA檢測與腫瘤組織相比，具有無創、快速、便捷等優點，這使ctDNA的CHFR甲基化評估有望成為臨床中的常規程式之一。

ctDNA甲基化

與NSCLC療效監測

腫瘤基因組的連續分析是NSCLC患者個體化治療的關鍵。目前基於影像學（胸部CT掃描）、腫瘤標誌物檢測等對治療反應的延遲評估，可能使患者暴露於不必要的藥物毒性，甚至延誤其他有效治療的時機。ctDNA甲基化監測可實時、敏感地反應治療中腫瘤負荷的變化，評估化療或手術後癌症複發的風險。

Wang等發現，ctDNA中APC或RASSF1A甲基化的定量監測可在化療後24 h預測腫瘤反應及藥物毒性。在肺癌患者全腫瘤切除術後，ctDNA中RARB2和RASSF1A甲基化指數均顯著降低，達到健康人水準。術後隨訪9個月，兩種基因中至少一種甲基化指數升高的NSCLC患者出現腫瘤複發，表明RARB2和RASSF1A甲基化是檢測腫瘤複發有價值的指標。另一項研究結果表明，p16、CDH13、APC和RASSF1A基因啟動子甲基化均與腫瘤的複發相關，分別參與細胞周期控制（p16）、侵襲和轉移（CDH13、APC）及Ras信號轉導通路（RASSF1A）。因此，ctDNA甲基化可作為金標準用於腫瘤組織檢測的重要補充，實時監測治療中腫瘤負荷的變化，追蹤NSCLC的治療反應，早期發現腫瘤複發。

展望

目前尚未發現對肺癌具有高敏感度和特異度的生物標誌物。隨著液體活檢技術的深入研究，大量證據表明，ctDNA可反映腫瘤基因組資訊，其甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，與肺癌的發生、發展關係密切，具有操作簡便、快速、無創、可重複、利於實時動態檢測等優勢，有望成為肺癌早期診斷、治療方案選擇、療效評估及預後判斷時的重要手段，從而推進精準醫療的實施。