癌症早期診斷及監測——循環腫瘤DNA檢測的應用

腫瘤的早期診斷和治療是保證腫瘤病人預後的重要因素。腫瘤的早期診斷一直是臨床研究的努力方向。目前的早期診斷技術很大程度上依賴於物理方法的檢查，比如放射影像學診斷，超聲波檢查。想做到確診則不得不有賴於組織的病理學檢查。但組織活檢已不能歸於腫瘤早期，而且一般為有創檢查。

隨著核酸測序技術的發展，測序的精準度空前提高，測序成本的持續下降，使得循環血中遊離DNA的檢測成為可能。伴隨著相關腫瘤機制研究的深入，生物大數據分析工具的成熟，循環腫瘤DNA檢測極有可能成為可以信賴的腫瘤早期診斷，腫瘤治療監測和腫瘤預後評估的無創檢查工具。本文就該領域的最新進展和潛在應用做簡要探討。

文/Stephen 王

編/HLR

1

循環遊離核酸的檢測

核酸作為遺傳資訊儲存及傳遞的大分子主要存在於細胞內，處於體液中遊離狀態的核酸一般含量極低，而且很不穩定。人類發現體液中存在遊離核酸的歷史可以追溯到70年前，但當時並不明了其存在的意義。後來人們把體液中遊離核酸與疾病聯繫起來，距今也有50年時間了（1）。

▲ 液體活檢示意圖

EurJ Hum Genet. 2018 Apr 23

核酸有很多種，基因組DNA，線粒體DNA，mRNA，microRNA，longncRNA等等。而所有這些種類的核酸成分，目前都可以在循環血中檢測到（1）。而且有很多研究發現了這些循環血中核酸成分的增加和心血管疾病，代謝疾病以及癌症的相關性。比如循環遊離線粒體DNA有可能和心血管病的高風險有相關性（2）。循環遊離小RNA和脂質代謝有潛在的相關性（1）。

在所有這些循環遊離核酸中，循環遊離DNA在癌症的診斷治療中的作用，研究的最透徹，應用的也最廣泛。

2

循環腫瘤標記物的檢測

在循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）之前，檢測循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell, CTC）是被廣泛接受的循環血腫瘤檢測技術。在循環血中做到腫瘤細胞的檢測需要兩步：腫瘤細胞的富集和腫瘤細胞的探測。

由於血中的細胞種類繁多，從眾多的血細胞中富集到足夠多的腫瘤細胞以作為檢測是一道艱難的屏障（3）。最近新的基於尺寸適應型的富集技術(Size-Based Enrichment)可以提高收取腫瘤細胞的效率（4）。第二步是通過蛋白核酸的檢測以確定腫瘤細胞的生物學特性。

CTC技術的優點在於引申步驟：收集到的腫瘤細胞可以用於進一步的體外細胞培養和擴增，可以用於蛋白，DNA和RNA的大分子功能檢測，甚至可以用於動物的體內實驗。CTC的主要局限在於它的代表意義：在非轉移癌的條件下，CTC幾乎很難檢測，意味著用於腫瘤的早期診斷有先天的不足，加上技術上的瓶頸帶來成本居高不下。

但是CTC檢測技術發展的時間相對較長，已經在其自身的檢測領域發展出了相對成熟和可靠的標準。強生公司的CellSearch 系統是目前FDA唯一批準的用於臨床的CTC檢測的平台（3）。

對比於CTC，循環腫瘤DNA的檢測則相對年輕。循環腫瘤DNA含量低，不像CTC那樣可以檢測除DNA以外其它大分子的生物活性，但是提取出來的DNA可以長期保存以供將來研究。

DNA含量低只是檢測ctDNA的技術難點之一。另一個難題在於如何鑒別一段檢測到的DNA是來源於腫瘤細胞還是血中其它的正常細胞。而對DNA序列的詮釋，則不得不歸功於多年的腫瘤細胞測序和腫瘤機制研究的積累。很多腫瘤DNA都帶有特定腫瘤的標誌物（某種「密碼」）。這種「腫瘤密碼」是DNA序列中特定區段的變異。通過比對這些位點的差異，可以判定DNA是否來源於某種腫瘤細胞（6-8）。

當然，腫瘤DNA檢測的指標不僅限於已知的變異位點，通過全基因組的掃描測序，會發現很多未曾報導或者尚未有明確意義的DNA變異（6-8）。而如何評估這樣的變異，它們是否具有可信的臨床意義，這些是目前技術革命帶給檢測領域的新挑戰。除此而外，通過檢測DNA的修飾，尤其是甲基化修飾也成為早期檢測「腫瘤密碼」的一部分（9,11）。

3

循環腫瘤DNA檢測的臨床應用

儘管大量的研究文章顯示，循環腫瘤DNA檢測的可操作性越來越強，應用價值巨大，應用前景廣闊，但迄今為止，循環腫瘤DNA檢測尚未被臨床腫瘤治療廣泛接受和認可（10）。主要問題在於檢測的靈敏度和特異性參差不齊，突變位點檢測的可重複性不強，潛在的新變異無法得到確認，檢測出的新靶點無法和腫瘤的發生髮展建立有效的關聯（6，10）。

目前大部分測序公司都可以檢測特定位點的DNA變異。但檢測位點的選擇卻並無統一標準。由紀念斯隆-凱特琳癌症中心開發的MSK-IMPACT, 2017年底成為FDA首次批準的多基因特定位點檢測系統（8）。

除了特定變異位點的檢測，DNA甲基化修飾的檢測在腫瘤中也成功的得到了應用。

中山大學和加州大學聖地亞哥分校合作發表於NATURE MATERILS的研究是相對系統性的大規模研究。基於肝癌病人的分期，存活率等大量數據，整合了DNA甲基化資料庫的已有資訊，開發新的機器學習模型，這項研究在肝癌病人循環DNA的甲基化檢測上打下了紮實的基礎（11）。

目前萊蒙君泰公司（LAM?,Laboratory for AdvancedMedicine, Inc.）利用該成果已經在國內和多家醫院聯合開展腫瘤循環DNA甲基化檢測（12）。

在美國市場，GRAIL是一家後起之秀。該公司計劃2018年在香港融資上市，5月21日宣布公司完成3億美元的C輪融資，由匯橋資本、高瓴資本與通和毓承共同領投，藍池資本、招商證券國際、國新科創基金、黃浦江資本(HPR)、工銀國際、紅杉資本，以及明碼生物等參與投資。

從測序巨頭Illumina公司分離出來的GRAIL，兩年前開始了一項規模浩大的循環腫瘤DNA的測序計劃。該項計劃招募病人數達萬人，計劃耗時五年，利用三種最成熟的循環腫瘤DNA檢測技術：腫瘤DNA特定位點的變異檢測（所用工具即上文提到的MSK-IMPACT系統）；腫瘤DNA的全基因組檢測；以及腫瘤DNA的甲基化檢測。檢測包括肺癌，卵巢癌，胰腺癌，肝癌，食管癌等多種腫瘤類型，三種方法並行檢測、比較，以期相互印證，分選優劣。

目前的階段性研究報告可以看出，這樣的檢測策略，大大提高了檢測的靈敏度和特異性（7,9）。五年隨訪檢測後，相信會給業界建立紮實的操作平台，樹立良好的參考標準。

4

循環腫瘤DNA檢測不僅僅是檢測技術

從循環血中提取腫瘤DNA並測序，起初的意義就是要在無創或微創的條件下，能夠對腫瘤做出早期診斷，甚至可以幫助醫生對腫瘤的治療進行監控。所以檢測終歸只是手段，臨床應用才是最終目的。

然而，由於循環腫瘤DNA的低含量以及DNA序列資訊的極端複雜性，使得提取檢測技術本身一度成為大家專註的焦點。而現階段提取和檢測技術已逐漸被市場化規範化，例如Vela診斷公司的遊離DNA提取試劑盒Sentosa? SX，近日已正式獲得國家市場監督管理總局批準，將來會廣泛服務於臨床（13）。

那麼當檢測技術日趨成熟，檢測結果日漸可靠的時候，怎麼解讀檢測結果成為能否整合到腫瘤治療環節的關鍵所在。

準確的解讀檢測結果需要多方面的資訊溝通，大批量的反覆印證，長時間的臨床隨訪觀察。有市場研究也指出，準確解讀是目前該領域的技術難點（14）。特定的檢測手段只能給出有限的參考資訊。比如腫瘤DNA特定位點的變異檢測，僅僅能覆蓋已知機理的腫瘤發病類型。對於更多的與癌症相關的DNA序列變異，需要靠全基因組測序來識別。但如何確認它們和腫瘤發生之間的關係，如何從海量的DNA序列多樣性的噪音背景下，把痕量腫瘤DNA變異的信號篩選出來（7），不光是測序技術的問題，更是檢測規模和檢測過程設計的問題。

檢測出的結果是否可靠還體現在檢測出的腫瘤DNA變異是否與腫瘤發病有明確的相關性。臨床中利用循環腫瘤DNA檢測不僅僅局限於早期的診斷篩查，還對腫瘤治療的監控有指導意義。這樣的問題靠大量的回顧性研究不能有效的回答。需要臨床醫生，病人，檢測部門在整個治療過程中的密切配合，及時反饋，這也是GRAIL公司計劃五年隨訪研究的意義所在。

循環腫瘤DNA檢測是個新興的領域，但是技術上已經相對成熟。目前的著眼點在建立該領域的規則和參考標準，這是一個邊研究邊建設的過程。眾多的測序公司可以提供大量的反覆印證的測序結果，同時更需要臨床醫生提供治療及疾病評估的反饋資訊。所以cell-freeDNA（cfDNA）檢測不僅僅是檢測而已，它是多方合作的長時間大投入的腫瘤治療環節的重要部分。

（圖片來源於網路）

參考文獻：

1.Circulatingcell-free nucleic acids: characteristics and applications. P?s O, Biró O,Szemes T, Nagy B. Eur J Hum Genet. 2018 Apr 23.

2.http://www.transbiomedicine.com/translational-biomedicine/the-cellfree-mitochondrial-dna-a-novel-biomarker-of-cardiovascular-risk.php?aid=9556

3.CirculatingTumor Cells (CTC) and Cell-Free DNA (cfDNA) Workshop 2016: ScientificOpportunities and Logistics for Cancer Clinical Trial Incorporation. Lowes LE,Bratman SV, Dittamore R, Done S, Kelley SO, Mai S, Morin RD, Wyatt AW, AllanAL. Int J Mol Sci. 2016 Sep 8;17(9).

4.Size-BasedEnrichment Technologies for Non-cancerous Tumor-Derived Cells in Blood.Mong J,Tan MH.Trends Biotechnol. 2018 May;36(5):511-522.

5.Cell-freeDNA (cfDNA): Clinical Significance and Utility in Cancer Shaped By EmergingTechnologies. Volik S, Alcaide M, Morin RD, Collins C. Mol Cancer Res. 2016Oct;14(10):898-908.

6.Next-GenerationSequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection. Aravanis AM,Lee M, Klausner RD. Cell. 2017 Feb 9;168(4):571-574.

7.https://grail.com/science/

8.https://www.mskcc.org/press-releases/msk-impact-first-tumor-profiling-multiplex-panel-authorized-fda-setting-new-pathway-market-future-oncopanels

9.https://www.businesswire.com/news/home/20180417006580/en/GRAIL-Announces-Data-Prototype-Blood-Tests-Early

10.Circulating Tumor DNAAnalysis in Patients With Cancer: American Society of Clinical Oncology andCollege of American Pathologists Joint Review. Merker JD, Oxnard GR, Compton C,Diehn M, Hurley P, Lazar AJ, Lindeman N, Lockwood CM, Rai AJ, Schilsky RL,Tsimberidou AM, Vasalos P, Billman BL, Oliver TK, Bruinooge SS, Hayes DF,Turner NC. Arch Pathol Lab Med. 2018 Mar 5.

11.Circulating tumour DNAmethylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma.XuRH, Wei W, Krawczyk M, Wang W, Luo H, Flagg K, Yi S, Shi W, Quan Q, Li K, ZhengL, Zhang H, Caughey BA, Zhao Q, Hou J, Zhang R, Xu Y, Cai H, Li G, Hou R, ZhongZ, Lin D, Fu X, Zhu J, Duan Y, Yu M, Ying B, Zhang W, Wang J, Zhang E, Zhang C, Li O, Guo R, Carter H, ZhuJK, Hao X, Zhang K. Nat Mater. 2017 Nov;16(11):1155-1161.

12.https://www.lamoncogroup.com/

13.https://www.prnasia.com/story/212711-1.shtml

14.https://mp.weixin.qq.com/s/SGaFZQlRxHU1C-DvjdpVvQ

本期作者：Stephen 王

德州大學休斯頓健康科學中心博士畢業。現於健康科學中心從事遺傳性心血管病研究。任美柏醫健研究員。

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