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深度丨RNA m6A修飾直接調控腫瘤發生嗎?這篇Nature有話說

撰文丨小白薯

責編丨迦漵

「科學總是在爭議中前行」

近年來,表觀遺傳修飾非常火熱。其中m6A是mRNA和lncRNA中最豐富的一種,主要存在於3』UTR。RNA的m6A修飾主要由三類蛋白參與調控,分別是:「編碼器(writer)」、「消碼器(eraser)」和「讀碼器(reader)」。被m6A修飾的RNA參與的功能非常廣泛,幾乎影響到了整個的mRNA的代謝:剪接、轉運、穩定性、翻譯效率、二級結構等。其生理功能也非常重要,此前已經被報導的重要功能包括:乾細胞發育、神經細胞增殖、免疫系統的穩態、白血病發生、癌症發生,等等等等。

然而,就是在這個十分火熱的領域,爭議似乎就沒有停止過。有人說m6A領域太過火熱—曾幾何時,隨便找一個重要的功能或者表型,做點RNA-seq和基因敲除,把數據和m6A關聯一下就能扯出一個大故事來,文章的起步價都是10分;有人說m6A領域的實驗很tricky,很多實驗是為了找數據而找數據;有人說m6A領域爭議的結論很多—曾幾何時,「Darnell父子與何川關於m6A修飾的『暗戰』」打得激烈,究竟m6A調控動不動態?曾幾何時—關於RNA去甲基化酶FTO的作用底物到底是誰,又是如何調控(真的搞錯了嗎?RNA去甲基化酶FTO的作用底物解讀丨特別推薦),直到最近才有了較清晰的答案(不能把「功勞」都算到m6A頭上,FTO不僅僅是m6A去甲基化酶)。

科學的發展與進步總是在不斷往前進行著,這些爭議從沒有休止過。這不,哈佛大學的Richard I. Gregory教授前不久又在Nature雜誌上丟出重磅炸彈,發表題為mRNA circularization by METTL3–eIF3h enhances translation and promotes oncogenesis的研究論文,提出了m6A甲基化核心催化酶METTL3調控癌症發生作用的新機制,表明METTL3的酶活並不是調控腫瘤所必須的。

此前多數人認為,m6A甲基化修飾在癌細胞中的作用是直接通過修飾影響的RNA水準變化,包括mRNA的穩定性、蛋白的翻譯效率、出核效率等。例如:康奈爾大學Hongjun Song及其同事發現m6A可以促進神經發生相關mRNA的降解【1】;國內曹雪濤院士組發現m6A修飾的RNA可以快速出核,去除m6A修飾可以是mRNA在核內滯留更久【2】;康奈爾大學的Shu-Bing Qian課題組發現在5』 UTR的m6A修飾可以促進eIF4F依賴的蛋白翻譯效率【3】;來自英國劍橋的Tony Kouzarides課題組發現METTL3可以結合在啟動子區域,然後促進相應mRNA的m6A修飾,從而調控急性白血病相關基因的表達【4】,等等。

現在我們可以知道,m6A修飾主要是METTL3-METTL14形成異源二聚體催化,其他眾多蛋白參與調控,其中METTL3又是真正起催化作用,而METTL14只是起到結構上的輔助作用【5】。METTL3蛋白序列主要分為三個部分:N端結構域、鋅指結構域和甲基轉移結構域(圖1)。通過結構生物學及生物化學手段已經知道,ZnF-MTD結構域組合的是METTL3-METTL14複合物甲基化活性所必須的【5】。

圖1. 人源METTL3的結構域示意圖

早在2016年,Richard I. Gregory課題組就已經報導了METTL3可以促進一些重要的癌症基因的翻譯(圖2)。但是與其他大多數不同的是,METTL3在這些癌細胞中促進翻譯效率的機制完全不依賴於METTL3的甲基化活性,而最短的僅需METTL3的前200個氨基酸與翻譯起始複合物亞基的相互作用就能實現(圖3)【6】。也就是說,這個過程中,METTL3在這裡增強翻譯的功能與作用已經與m6A修飾沒有任何關係了。但是其中的分子機制並不清楚。

圖2. Richard I. Gregory課題組在2016年發在Molecular Cell的文章

圖3. 2016年Richard I. Gregory組鑒定METTL3的結構域對翻譯效率的影響

最近的這篇Nature文章中,Richard I. Gregory組提出了在某些癌細胞中,METTL3促進翻譯的分子模型——只有當METTL3被拉到報告基因mRNA終止密碼子附近時,才能起到增強翻譯的作用,原因是:由於METTL3與翻譯起始複合物因子eIF3h相互作用,容易使得此時的mRNA形成loop環,使得mRNA和核糖體再循環利用的效率大大增強,從而表現出翻譯效率的提升(圖4)

圖4. METTL3促進翻譯效率的分子機制模型

下面我們看看他們是怎麼鑒定到這個機制的。

首先,基於他們2016年的研究結果,Richard I. Gregory組通過一個熒光報告系統,發現只有當METTL3被拉到3』UTR的終止密碼子附近時,才能促進報告基因的翻譯效率(圖5a,b)。進一步的mapping實驗結果顯示,METTL3促進翻譯效率基本上不依賴甲基化活性位點(METTL3 Mut為催化活性位點突變),並且METTL3的前1-200氨基酸就能有效的促進翻譯(圖5c)

圖5. 檢測METTL3促進翻譯效率的熒光報告系統

對於翻譯來說,起始步驟是整個過程的限速步驟。前人就已經有很多報導,提出促進翻譯效率的機制可以通過mRNA成環--由翻譯起始因子eIF4G和PABPC1(poly(A)binding protein cytoplasmic 1)介導,通過帽子結構的5"端和polyA 3"末端之間的相互作用形成,從而使翻譯效率提升【7,8】。

接著,他們順著同樣的思路,檢測METTL3是否介導mRNA的環化。他們直接通過蔗糖密度梯度離心和電鏡鏡檢,觀察到METTL3可以使mRNA環化,形成環形的polyribosomes(圖6a,b)。同樣地,不管是METTL3的全長蛋白,還是前200個氨基酸的截短,都能有與野生型一樣的效果(圖6d,e)。通過相互作用組分鑒定,進一步確定是METTL3的前200個氨基酸區段與翻譯起始複合物的組分eIF3h相互作用,使得mRNA「頭尾相接」,形成環狀(圖6c-f)。將eIF3h敲除,將直接消除METTL3增強翻譯效率的作用(圖6g,h),說明mRNA的環化作用時通過METTL3-eIF3h相互作用介導。

圖6. METTL3通過與eIF3h相互作用增強翻譯

然後,他們把這個體系應用到大量的其他mRNA上,發現METTL3的敲除對大量的mRNA(4267)的翻譯效率有下調作用,其中809個與METTL3直接相關(圖7d)。癌症基因關聯分析顯示這些基因主要參與癌症發生和細胞凋亡。RT-PCR結果顯示METTL3的敲除對mRNA的豐度影響不大,但是卻可以強烈的下調其翻譯效率(圖7f)。更有意思的是,不管是RNA-seq分析還是單基因RT-PCR分析,結果都一致顯示METTL3的敲除對於mRNA的穩定性沒有任何影響,也就是說m6A的有無對mRNA的穩定性沒有關係,這與之前的許多報導—m6A可以增強或減弱RNA的穩定性--似乎產生了衝突。作者還做了很多其他實驗去佐證METTL3可以在肺癌細胞中增強翻譯效率的結果。

圖7.METTL3促進大量mRNA的翻譯效率

進一步考慮到METTL3的1-200可以促進mRNA的翻譯,而1-150則不能(圖5c),說明150-200的作用對METTL3-eIF3h相互作用尤為重要。二級結構預測和序列分析表明150-161是高等動物中一段非常保守的α螺旋。當把這段中的156為的Ala突變為Pro,則破壞這段完整的結構時,METTL3促進翻譯的效率則被嚴重削弱,但是它與METTL14的相互作用沒有任何影響(只要METTL3包含ZnF-MTD,活性就不會有影響)。表達突變的METTL3(A156P)也不能回補METTL3敲除細胞系的表型(圖8a,b,e)。這些結果表明,儘管METTL3(A156P)可以與METTL14相互作用,行使甲基化的功能,但是它與翻譯起始因子的相互作用被嚴重削弱。

還有更有意思的故事。把METTL3拉到缺少polyA尾巴的mRNA中,對翻譯的促進效果更加明顯,而對於突變的METTL3(A156P)則沒有。通過電鏡鏡檢分析,野生型METTL3拉出來的polysome堆積更加緊密,呈現緊密的環形或者球形聚集體;而對於突變的METTL3(A156P),拉出來的polysome則呈現線性(圖8h),說明METTL3(A156P)不能使mRNA環化。這對於METTL3使得mRNA環化給出了最直接的證據。

圖8. METTL3的150-200區段對相互作用很重要

到這裡還沒有結束。Richard I. Gregory還做了一些細胞生物學實驗來證明METTL3在癌細胞中的作用(圖9d-i)。實驗結果都很一致,在測試的肺成纖維細胞(圖9e)、NIH-3T3(圖9f)、小鼠胚胎成纖維細胞(圖9g)、MB352細胞系(圖9h)中,實驗結果都表明METTL3可以增強翻譯並促進癌變進程,而突變體METTL3(A156P)則不能(圖9)。我們都知道,癌細胞通常需要更多的能量,代謝更加活躍,而通過增強翻譯效率來循環利用能源、提高效率,可謂是癌細胞的聰明之舉!這些結果表明METTL3在癌細胞中的作用是非常重要的,這也可能為癌症治療提供新的觀點。

圖9. METTL3在不同細胞系中的作用

最後的一個結論。作者通過meRIP–seq測序,鑒定到METTL3結合的位點主要在GGAC motif,也主要分布在靠近3』UTR的終止密碼子附近(圖10),這似乎是意料之中。作者也很好的解釋了這一點,正因為METTL3結合的位置在終止密碼子附近而不是3』UTR的尾巴上,所以才使得METTL3與eIF3h相互作用後,核糖體在終止密碼子掉下來,就能很快的再循環,從而進一步解釋了METTL3促進翻譯的機制。

圖10. METTL3主要富集在終止密碼子附近

綜上所有的結果,METTL3通過與eIF3h相互作用,使mRNA環化,形成loop,使得核糖體的回收再利用的效率提高,從而增強了翻譯效率(圖4),這些機制在癌細胞中尤為明顯和重要。這個在終止密碼子和5』端的成環機制也許是一種更為高產高效的循環利用核糖體的方式,而且是通過終止密碼子,而不是冗長的3』UTR尾巴。

另外,本文的亮點在於,儘管在這個過程中是m6A的核心催化酶METTL3在起作用,但是這個過程中的調控可能跟RNA的m6A修飾沒有太多關係。此前很多報導都說是m6A修飾使得RNA的穩定性改變,再影響到了翻譯效率。在此之後,也許m6A修飾本身跟RNA的翻譯效率沒有關係,只是「METTL3已經在這個位置了,『順帶』把這個位點催化一下,其實它主要是來環化mRNA的!」

原文鏈接:https://www.nature.com/articles/s41586-018-0538-8

通訊作者簡介:

Richard I. Gregory博士,哈佛醫學院生物化學與分子藥理學系,兒科學教授,波士頓兒童醫院血液腫瘤科乾細胞計劃首席研究員。同時還是哈佛乾細胞研究所的首席教員,哈佛RNA醫學倡議的聯合主任和執行委員會成員。

Gregory博士於2001年從劍橋大學獲得博士學位,博士後工作在Fox Chase癌症中心和費城Wistar研究所進行。 Gregory博士的博士後研究重點關注miRNA生物發生和功能的機制,並得到Jane Coffin Childs Research Fellowship的支持。自2006年成立實驗室以來,Gregory實驗室的研究重點是了解控制RNA生物發生和衰變的分子和細胞機制,並探索這些途徑在乾細胞多能性、哺乳動物發育和人類疾病中的相關性。同時,Gregory博士致力於利用RNA調節途徑的基本知識,為癌症和癌症及其他疾病的發現和開發新的有效療法。現在的主要工作分為三個領域:

1)在胚胎乾細胞中闡明miRNA生物發生和功能的機制。

2)研究新鑒定的ncRNA品質控制途徑的分子、細胞和發育作用。

3)探索乾細胞和癌症中「epitranscriptome」的機制和相關性。

目前以第一作者或通訊作者發表論文40餘篇,包括數篇發表在CNS正刊。

參考文獻:

1 Yoon, K.-J. et al. Temporal control of mammalian cortical neurogenesis by m 6 A methylation. Cell 171, 877-889. e817 (2017).

2 Zheng, Q., Hou, J., Zhou, Y., Li, Z. & Cao, X. The RNA helicase DDX46 inhibits innate immunity by entrapping m 6 A-demethylated antiviral transcripts in the nucleus. Nature immunology 18, 1094 (2017).

3 Coots, R. A. et al. m 6 A Facilitates eIF4F-Independent mRNA Translation. Molecular cell 68, 504-514. e507 (2017).

4 Barbieri, I. et al. Promoter-bound METTL3 maintains myeloid leukaemia by m 6 A-dependent translation control. Nature 552, 126 (2017).

5 Huang, J. & Yin, P. Structural Insights into N 6-methyladenosine (m 6 A) Modification in the Transcriptome. Genomics, proteomics & bioinformatics (2018).

6 Lin, S., Choe, J., Du, P., Triboulet, R. & Gregory, R. I. The m 6 A methyltransferase METTL3 promotes translation in human cancer cells. Molecular cell 62, 335-345 (2016).

7 Imataka, H., Gradi, A. & Sonenberg, N. A newly identified N‐terminal amino acid sequence of human eIF4G binds poly (A)‐binding protein and functions in poly (A)‐dependent translation. The EMBO journal 17, 7480-7489 (1998).

8 Wells, S. E., Hillner, P. E., Vale, R. D. & Sachs, A. B. Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors. Molecular cell 2, 135-140 (1998).

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