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Science丨湯富酬/喬傑/付衛合作組揭示人類結直腸癌發病新機制

責編 | 迦漵

單細胞三重組學測序方法

結直腸癌(Colorectal cancer)是發病率和死亡率很高的一種癌症【1】。基因組不穩定性【1,2】、表觀遺傳學異常【3,4】及基因表達紊亂等是結直腸癌典型的分子特徵。腫瘤組織具有很強的異質性,以往在大量細胞水準的研究只能反映腫瘤組織的系綜平均情況,而無法精準區分不同的腫瘤亞克隆以及腫瘤微環境中的其他細胞類型【5】。一般的單細胞單組學測序技術只能分別研究單細胞基因組、單細胞DNA甲基化組、或者單細胞轉錄組,不能做到在一個單細胞中同時平行分析多個組學層面。

2016年2月,北京大學湯富酬研究組與合作者在Cell Research上發表論文,建立了一種全新的單細胞三重組學測序方法scTrio-seq(single-cell triple omics sequencing technique),在國際上首次從同一個單細胞中實現對基因組、表觀組和轉錄組高通量測序資訊的同時獲取,並從單細胞水準發現肝癌細胞在三種組學上存在密切相互關聯的高度異質性【6】。因此,將上述技術運用於從單細胞解析度、多組學水準深入解析了人類結直腸癌的發生和轉移過程具有十分重要的意義。

2018年11月30日,北京大學生物醫學前沿創新中心(BIOPIC)、北京未來基因診斷高精尖創新中心(ICG)湯富酬研究組與北醫三院付衛研究組、喬傑研究組在Science雜誌上發表了題為Single-cell Multi-omics Sequencing and Analyses of Human Colorectal Cancer 的研究論文。該研究在國際上首次從單細胞解析度、多組學水準深入解析了人類結直腸癌在發生和轉移過程中,基因組拷貝數變異、DNA甲基化異常及基因表達改變的特點及相互關係。

在該項研究中,研究人員對患有結直腸癌並伴隨轉移的12例患者的原發位、淋巴結轉移位、肝轉移位等樣品進行了多點取樣,對1,800多個細胞進行了高精度的單細胞多組學測序(scTrio-seq2,scTrio-seq的更新版),共產生了7.6 Tb高品質的測序數據。scTrio-seq2的DNA甲基化組部分,平均每個細胞的測序量為4.1 Gb,平均覆蓋到全基因組範圍的870多萬個CpG位點;scTrio-seq2的轉錄組部分,平均每個細胞測序量為0.9 Gb,平均可覆蓋到3700多個基因

課題研究思路及多點取樣示意圖

0 1

基於DNA甲基化組數據推斷出的基因組拷貝數變異精準鑒定了腫瘤細胞的亞克隆。

該研究精準鑒定出了結直腸癌患者單個癌細胞的染色體拷貝數變異譜,並利用其高精度的染色體內斷點資訊進行了腫瘤細胞的譜系追蹤。對於其中5例患者,在每個患者腫瘤組織中鑒定出了多個(6-13個)腫瘤細胞亞克隆,發現原發位腫瘤的亞克隆結構通常比轉移位腫瘤更複雜。

CRC01患者的腫瘤亞克隆結構示意圖

0 2

系統解析了腫瘤細胞的DNA甲基化異質性。

在全基因組水準,檢測到腫瘤細胞的DNA甲基化水準普遍低於癌旁的正常上皮細胞,而且DNA甲基化降低的程度存在很大的異質性。與癌旁的正常上皮細胞相比,單個腫瘤細胞全基因組DNA甲基化水準可降低7-36%。

0 4

闡釋了DNA甲基化譜和基因表達譜的相互關係。

在單細胞水準,基因啟動子區域的DNA甲基化與相應基因的表達呈現強烈的負相關關係,而基因區的DNA甲基化與相應基因的表達呈現正相關關係。對於測序單細胞數量較多的4例結直腸癌患者,其中1例患者腫瘤細胞的轉錄組亞群、遺傳亞群(亞克隆)、和DNA甲基化亞群三者之間呈現出一一對應關係;而在另外3例患者中,轉錄組亞群、遺傳亞群(亞克隆)、以及DNA甲基化亞群三者之間的關係較為複雜,沒有簡單的一一對應關係。

0 5

首次在單細胞解析度追蹤了同一遺傳譜系的腫瘤細胞在轉移過程中DNA甲基化及基因表達的變化情況。

對於同一個癌症患者同一遺傳譜系的腫瘤細胞在從原發灶到轉移灶的轉移過程中其全基因組DNA甲基化水準相對穩定,而基因組局部區域的DNA甲基化水準可能發生較大變化。上皮-間充質轉化相關的重要基因在轉移前後的腫瘤細胞中其RNA表達水準和DNA甲基化水準均沒有發生顯著改變。

0 6

揭示了結直腸癌細胞DNA去甲基化的共同特點。

在全部進行了單細胞基因組DNA甲基化測序的10個患者中,腫瘤細胞的DNA去甲基化程度與相應基因組區域在癌旁正常上皮細胞中的DNA甲基化水準呈現正相關關係,也就是說,在正常上皮細胞中DNA甲基化越高的基因組區域,其DNA去甲基化越強烈(DNA甲基化降低的絕對值和降低的相對比例都更大)。DNA去甲基化的程度與基因組重複序列L1以及癌旁正常組織中H3K9me3標記的異染色質區域的分布密度呈現強烈的正相關關係,而與開放的染色質區域以及H3K4me3標記的基因組區域呈現強烈的負相關關係。與正常的早期胚胎髮育過程中的兩次大規模基因組DNA去甲基化相反,相比於L2基因組重複序列,進化上更為年輕、更為活躍的L1基因組重複序列經歷了更強烈的DNA去甲基化。

0 7

揭示了結直腸癌細胞染色體水準的DNA甲基化異常和基因組不穩定性的特點。

在結直腸癌細胞中,相比於其他17條染色體,有6條染色體(4號、5號、8號、13號、18號、和X染色體)傾向於發生更強烈的DNA去甲基化。其中8號、13號、和18號染色體在TCGA資料庫(178個非高頻點突變類型的病例樣本)以及該研究的12個病例中均同時具有高頻的拷貝數變異。在這6條基因組DNA去甲基化更強烈的染色體中,有5條染色體(4號、5號、8號、13號、和X染色體)也同時顯著富集基因點突變(單核苷酸變異)。

總的來說,該研究通過對10例結直腸癌患者的高精度單細胞多組學測序分析和深度數據挖掘,研究揭示了結直腸癌腫瘤發生和轉移過程中基因組DNA甲基化變化的關鍵特徵,提示在腫瘤發生過程中大規模的DNA去甲基化很可能是早期事件,並在後續腫瘤轉移過程中保持相對不變,說明相對穩定的全基因組DNA低甲基化是結直腸癌每個腫瘤細胞的基本特徵。而同一個患者的同一個亞克隆的腫瘤細胞其轉錄組可以仍然有強烈的異質性,並且同一個患者的不同亞克隆的腫瘤細胞可以有相同的轉錄組亞群,說明腫瘤細胞的轉錄組特徵中很大一部分是對腫瘤微環境的動態響應而不完全是由其遺傳譜系決定的。

該研究既發現了結直腸癌細胞基因組DNA甲基化層面強烈的患者個體間差異以及個體內的腫瘤細胞異質性等個性特徵,同時也發現了不同患者個體之間、不同腫瘤部位之間腫瘤細胞DNA甲基化改變的共性規律,對於基於乾預DNA甲基化的腫瘤治療方案給出了新的啟示。

據悉,北京大學生物醫學前沿創新中心、北京未來基因診斷高精尖創新中心、生命科學聯合中心博士生卞舒惠,北京大學生命科學學院、生物醫學前沿創新中心博士生侯宇、李顯龍、王藝橙,以及北醫三院周鑫博士、雍軍博士為該論文的並列第一作者;北京大學湯富酬教授、北醫三院付衛教授、喬傑教授為該論文的共同通訊作者。

參考文獻:

1、Cancer Genome Atlas Network. (2012). Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature, 487(7407), 330.

2、Guinney, J., Dienstmann, R., Wang, X., De Reyniès, A., Schlicker, A., Soneson, C., ... & Bot, B. M. (2015). The consensus molecular subtypes of colorectal cancer. Nature medicine, 21(11), 1350.

3、Hinoue, T., Weisenberger, D. J., Lange, C. P., Shen, H., Byun, H. M., Van Den Berg, D., ... & Tollenaar, R. A. (2012). Genome-scale analysis of aberrant DNA methylation in colorectal cancer. Genome research, 22(2), 271-282.

4、Berman, B. P., Weisenberger, D. J., Aman, J. F., Hinoue, T., Ramjan, Z., Liu, Y., ... & Van Den Berg, D. (2012). Regions of focal DNA hypermethylation and long-range hypomethylation in colorectal cancer coincide with nuclear lamina–associated domains. Nature genetics, 44(1), 40.

5、McGranahan, N., & Swanton, C. (2015). Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer cell, 27(1), 15-26.

6、Hou, Y., Guo, H., Cao, C., Li, X., Hu, B., Zhu, P., ... & Tang, F. (2016). Single-cell triple omics sequencing reveals genetic, epigenetic, and transcriptomic heterogeneity in hepatocellular carcinomas. Cell research, 26(3), 304.

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