趙景民：跟蹤非酒精性脂肪性肝病的臨床試驗-病理學終點評價

蔣麗娜，趙景民

解放軍第三〇二醫院

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種代謝應激性肝損傷，與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關，疾病譜包括非酒精性單純性肝脂肪變，非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化和肝細胞癌等一系列病變。我國NAFLD流行率為15%~40%，並呈較明顯遞增態勢。目前NAFLD相關臨床研究主要集中於新葯研發、治療/診斷新技術、NAFLD評價方法的研究和生活方式改善對NAFLD的影響等方面。新葯臨床研發方面尚無獲準的NAFLD治療藥物面世，NAFLD治療藥物的靶點主要針對肝細胞脂質聚集及代謝應激、氧化應激及氧化應激後的炎症和損傷、腫瘤壞死因子α通路及免疫調節、胃腸道相關靶點（包括抗肥胖劑或胃腸道微生物調節劑）等。NAFLD新葯臨床研究的核心目標是防治肝硬化等終末期肝病，NASH發展為肝硬化的延續時間長達數十年，周期長且難以界定，因此臨床研究中通常用替代治療終點評估療效。臨床研究通常使用NASH逆轉或緩解，肝纖維化無進展作為防治NAFLD/NASH相關肝纖維化研究的替代終點。影像學及血清學等無創評價方法特異性和敏感性均待提高，尚不能完全替代組織學評估。肝活組織檢查是NAFLD/NASH診斷的「金標準」，組織學評價具有準確、直觀、可評分定量等特點，在NAFLD/NASH臨床研究中優勢明顯。在跟蹤性NAFLD/NASH 臨床試驗研究中，肝組織學評價作為研究隊列入組診斷/排除診斷及主要治療終點評價的主要指標，能夠準確直觀地判斷患者肝臟的變化。本文結合2011年美國肝病學會（AASLD）年會、2013年AASLD和美國食品藥品監督管理局 (FDA)會議內容及目前臨床研究的熱點，對跟蹤NAFLD臨床試驗中病理學治療終點設計、病理學評估方法的進展進行評述。

1 跟蹤NAFLD臨床試驗中病理組織學終點的設計

治療NAFLD/NASH的主要目標是防治肝硬化引起的死亡，NASH發展為肝硬化通常會延續10~20年，甚至更長，臨床研究中很難設計如此長周期的試驗來確定治療優勢，因此使用替代終點評估NASH肝硬化和肝病相關死亡風險十分必要。相比非酒精性單純性肝脂肪變的患者，NASH患者更容易發展至肝硬化乃至肝病相關死亡，因此NASH逆轉，且肝纖維化無進展，或肝纖維化有實際改善，通常作為臨床研究的主要治療終點，並作為預防肝硬化和肝病相關死亡的合理替代指標。早期和探索性研究（1期和2a期）主要評估新葯耐受性和排除研究中的無關變數，以指導藥物進一步研發與臨床實驗。結合磁共振等無創評價方法可確定肝脂肪變的改善，AST和ALT持續改善等可以作為有效的治療終點。2b期和3期臨床試驗的最佳時長尚無定論，通常以病理學評估作為研究隊列入組診斷與排除診斷、主要治療終點評價的主要指標。臨床試驗表明，NASH逆轉及組織學改善往往在6~12個月之後，因此臨床研究周期至少應觀察12個月。肝纖維化的臨床顯著改善相比NASH組織學特徵的改變需要更長的時間。如果將纖維化改善作為主要評價指標則至少需要1~2年時間，且需要在停葯之後跟蹤6個月以上。跟蹤NAFLD臨床試驗病理組織學終點的設計要綜合考慮研究中目標疾病的發病機制、組織學特點、發病周期及實施乾預的種類等內容，並根據研究的具體特點進行調整，以期獲得可靠的評估效果。

2 跟蹤NAFLD臨床試驗中病理組織學評價

診斷脂肪性肝炎的標準為肝臟脂肪變性比例＞ 5％、肝臟炎症和肝細胞氣球樣變，成人的典型特徵主要分布在小葉中央區（腺泡3區）。Mallory-Denk小體的存在能夠支持診斷，但並不是脂肪性肝炎診斷的必要因素。兒童患者相比成人在組織學上存在不同的分布趨勢，例如兒童的門靜脈區病變更為顯著。確診NASH存在3區大泡性脂變、小葉炎症和肝細胞氣球樣變即能明確診斷NASH。邊緣NASH的穿刺標本不充分滿足經典診斷標準，病變雖然主要存在於3區腺泡，但肝細胞氣球樣變並不典型甚至難覓。需要指出的是兒童NAFLD/NASH肝細胞脂變通常以大泡型為主，且不限於肝腺泡3帶，可呈全腺泡或匯管區周圍分布；匯管區炎症較成人為重；有些病例纖維化進展較快。

儘管肝穿刺檢查存在有創性、取樣和評價誤差等局限性，但在跟蹤NAFLD/NASH 臨床試驗研究及新葯臨床試驗中，肝組織學評價在評價臨床研究隊列入組/排除標準的設定，治療終點的選擇方面有重要作用，通常設定為跟蹤性臨床研究的主要評價指標。NAFLD/NASH 的組織學評價系統主要包括Brunt系統、美國NASH臨床研究網路評分系統（NASH-CRN）、歐洲SAF/FLIP 評分系統和兒童NAFLD/NASH 組織學評分系統，其中，NASH-CRN是跟蹤NAFLD/NASH臨床試驗研究中推薦的組織學評分系統。在NASH-CRN評分系統中，NASH活動度（NAS）是脂肪變性、小葉炎症（LI）和氣球樣變積分的總和，代表組織學炎症壞死程度，但每種病變未加權評分。NAS≥5分為肯定的NASH，5＞NAS≥4分為邊緣NASH，NAS＜3可排除NASH。纖維化分期從０期~４期，肝纖維化１期又細分為１a（肝腺泡３區竇周纖細的纖維化）、１b（肝腺泡３區竇周較緻密的纖維化）和１c（匯管區周圍纖維化），1a與1b是纖維化分期的遞進關係，而1c 與1a、1b的區別是早期NASH肝纖維化分布部位的不同。在歐洲肝病指南中，將≥F2定義為顯著的肝纖維化，≥F3 為進展期纖維化，F4是早期和明確的肝硬化。

跟蹤NAFLD/NASH臨床試驗研究尤其是2b和3期臨床試驗，主要治療終點建議設定為NASH逆轉，即NASH組織學逆轉，包括氣球樣變消失（0 分），小葉炎症消失或持續的輕度LI（0或1分），組織學診斷為單純脂肪肝（NAFL）或NAFL伴輕度炎症，且無纖維化進展［纖維化進展是指纖維化分期（評分）增加］；或主要治療終點為NAS評分下降２分或以上，且至少一個以上組織學參數降低1分（肝細胞氣球樣變、脂肪變、小葉炎症、PI）以上，無纖維化進展，完成基線至主要治療終點的全程治療。

組織學評價品質受多種因素影響，包括活檢方式、活檢類型（粗針穿刺/楔形活檢）、穿刺部位、穿刺針規格以及病理學專家間評估的偏倚等。為保證組織學評價品質，穿刺肝組織應大於2 cm（包含10個以上完整的匯管區），使用小於16G穿刺針，經皮肝右葉穿刺活組織檢查，符合要求的肝穿標本藉五萬分之一的穿刺樣本代表肝臟的整體病變。為保證組織學樣本的處理品質，要求嚴格遵循病理樣本SOP程式處理，建議進行集中切片染色以避免切片染色偏倚。組織學染色應至少包括HE染色、Masson三色染色，必要時可進行網狀纖維染色、鐵/銅染色、d-PAS染色，還可進行相關標誌物的免疫組化染色如反映肝纖維化活動性指標的α-平滑肌肌動蛋白等。為減少病理學專家之間評估的偏差，建議由2名以上肝病病理專家進行單盲或雙盲病理中心集中閱片。

3 跟蹤NAFLD臨床試驗中病理組織學評價與無創評價方法的聯繫

無創評價研究熱點包括：診斷NAFLD/NASH方法的研究、評估NASH肝纖維化分期的研究和NAFLD/NASH治療效果評價的研究等方面。無創評價方法在NAFLD診斷中發揮重要作用，能夠輔助組織學診斷，但目前存在的無創評價方法準確性不足，無創評價結果與組織學結果的匹配度有待提高，尚不足以替代肝穿。進行NAFLD無創診斷標誌物研究時，應參照已有的生物標誌物標準。早期階段探索性跟蹤NAFLD/NASH臨床試驗中，磁共振彈性成像（MRE）和肝瞬時彈性成像（TE）等影像學無創技術可以輔助評價NAFLD/NASH肝纖維化程度，是有效的輔助病理學評估診斷NAFLD/NASH及相關纖維化的方法。磁共振質子密度脂肪分數(MRI-PDFF)及受控衰減參數(CAP)可評價肝脂肪含量，可輔助病理學評估對主要靶向脂肪肝的藥物進行評價，但由於肝臟炎症、膽汁淤積、操作誤差等因素影響，影像學無創診斷在跟蹤NAFLD/NASH研究的炎症活動度、纖維化分期和療效判斷方面，尚不能代替肝組織學評估。血清學無創診斷指標通常在臨床研究中輔助病理學評估診斷NAFLD/NASH，通常與肝臟炎症損傷及糖脂代謝相關，如肝臟酶類、TBil、BMI、血糖、糖化血紅蛋白、血脂和胰島素抵抗等指標相關，可輔助評價脂肪變性和炎症改善效果。此外，還有多種評價肝纖維化的模型，如FibroTest、Pro-C3、FIB-4、NAFLD 纖維化評分(NFS)、ELF等可輔助肝纖維化及肝硬化診斷。總之，NAFLD/NASH無創評價方法種類繁多，但其敏感度和特異度仍不足，在無創評價方法的研究中，組織學評估通常作為衡量標準以確定無創評價方法的臨床實用性和準確性，無創評價方法與組織學評價結果的匹配程度決定了無創評價的可靠性。

4 展望

跟蹤NAFLD/NASH臨床研究的病理組織學評估目前存在的「瓶頸」是研究中通常需要進行2次肝穿，患者接受度和依從性較差，但目前尚無可靠的無創評估方法替代病理組織學評估方法。積極研發與病理組織學評估匹配的無創診斷新技術是臨床試驗研究中亟待解決的課題。目前，組織學評估還存在一定局限性，實際操作中，穿刺活組織檢查的組織量較少，而NAFLD/NASH的病變在整個肝臟中並非完全均一分布，穿刺標本只能顯示局部肝組織病變特點，聯合多種診斷方法綜合判斷病情乃是未來NAFLD/NASH臨床方法學研究的大趨勢。新興電腦輔助病理學量化評價方法及形態學人工智慧技術進步迅猛，與組織學量化評價結合是新型組織學量化評分技術的發展方向。近年來NAFLD/NASH的病理機制研究和治療藥物靶點研究有很大進步，針對多靶點的「雞尾酒」藥物是NAFLD/NASH新葯研發的方向之一，同時中醫中藥及天然藥物治療NAFLD/NASH的研究也初露端倪，病理組織學評估在新葯臨床研究中發揮重要作用。跟蹤性NAFLD/NASH臨床研究的病理學評估將會隨著量化技術的進步，多種方法的綜合應用進一步優化。

引證本文：蔣麗娜, 趙景民. 跟蹤非酒精性脂肪性肝病的臨床試驗-病理學終點評價[J]. 臨床肝膽病雜誌, 2018, 34(12): 2505-2508.