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APASL2019中國之聲丨研究基礎與臨床複雜性—從概念出發不忘實踐初心

編者按:

第28屆亞太肝病研究學會年會(APASL2019)正在菲律賓馬尼拉火熱召開。在今天的Late Breaking Abstracts - Oral Research Presentation環節,北京大學醫學部基礎醫學院魯鳳民教授團隊有兩項研究入選。這兩項研究也是魯鳳民教授團隊分別與解放軍第五醫學中心趙景民教授、德國Hamburg-Eppendorf大學醫學中心Maura Dandri教授,以及與北京大學人民醫院魏來教授、中國醫科大學附屬盛京醫院感染科竇曉光教授和美國Baruch S. Blumberg研究所的郭巨濤教授合作開展的成果。研究成果介紹如下,希望在幫助大家加深對B肝疾病認識的同時,也能引發對B肝基礎和臨床研究的思考。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可引起急慢性病毒性肝炎、肝硬化及失代償性肝硬化和肝癌,是嚴重危害人類健康的全球性公共衛生問題。共價閉合環狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)攜帶HBV複製所需的全部遺傳信息,可在靜止狀態肝細胞的細胞核中長期穩定存在,是HBV持久複製和建立持續感染的重要根源。

HBV複製具有獨特的逆轉錄過程,即在新組裝的核衣殼內,病毒p蛋白以轉錄自cccDNA的前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)為模板首先合成病毒DNA的負鏈,進而再以負鏈為模板合成正鏈。正鏈短於負鏈,且正、負鏈均不閉合,因此稱為鬆弛環狀DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)。含有rcDNA的核衣殼獲得病毒外膜並釋放入血,形成子代病毒,或核衣殼內的這些從頭合成的rcDNA再進入細胞核,補充cccDNA池。

核苷(酸)類似物(nucleos(t)ide analogues,NAs)是目前臨床上應用最廣泛的抗HBV藥物,該類藥物可以顯著抑製病毒的複製並阻滯疾病進展。已知NAs作用的主要機制是在病毒p蛋白介導的病毒DNA合成過程中,與天然核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的同類物競爭,摻入正在合成的HBV DNA鏈中,使得新鏈延伸合成被提前終止,從而抑製病毒基因組DNA的複製。NAs的摻入將導致新合成DNA鏈的不可逆終止,產生負鏈DNA長短不一的子代「病毒」。理論上講,這些子代病毒應缺乏感染性,但目前尚缺乏直接的實驗證據。

此外,並非所有的慢性HBV感染者在NAs治療過程中都能獲得良好的病毒學應答。在臨床實踐中人們注意到,那些有明顯肝臟炎性損傷的慢性B肝患者往往更能夠獲得良好病毒學應答,這提示除了病毒學因素外,宿主針對HBV病毒感染的反應也發揮著至關重要的作用,但其具體機制並未完全闡明。

本次報告的兩項研究分別針對上述兩個問題開展。來自魯鳳民教授團隊的在讀博士研究生閆穎和劉永振同學分別代表合作團隊進行了口頭報告。

研究一 增殖肝細胞的NTCP膜表達水準降低以抵抗HBV感染

既往人們已經注意到,在急性HBV感染的病毒快速清除以及慢性HBV感染的持續炎症過程中,天然免疫和適應性免疫可以通過不同方式清除病毒。一方面,免疫系統可以直接降解cccDNA,以非殺傷宿主細胞的方式清除病毒;另一方面,CD8+ T細胞通過直接殺傷HBV感染的肝細胞來清除病毒。後者往往會引發肝細胞的代償性增殖。近來有研究利用人肝細胞嵌合小鼠模型,通過對HBV感染的人肝細胞的二次移植和誘導分裂增殖實驗發現,人肝細胞中的cccDNA會隨著肝細胞的增殖過程被不斷稀釋甚至丟失,從而產生cccDNA清除的新生肝細胞,據此認為這有助於cccDNA的清除和HBV感染的控制。但是處於增殖狀態的肝細胞是否對HBV感染抵抗,目前尚未見詳細報導。

鈉離子/牛磺膽酸共轉運蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)是HBV進入肝細胞的受體,其表達水準與HBV感染密切相關。魯鳳民教授與趙景民教授和Dandri教授的合作研究發現,在肝細胞處於增殖狀態時,NTCP的膜表達水準降低,使得增殖狀態肝細胞對HBV感染抵抗,這也是加速HBV清除的重要機制之一。

他們在體外細胞實驗中發現,將HepG2-NTCP細胞阻滯在G0/G1期後,NTCP膜表達水準升高,HBV感染效率提高。在HBV感染的人肝嵌合小鼠體內,僅在大多數人原代肝細胞停止增殖、NTCP蛋白質的細胞膜表達水準恢復正常後,HBV再感染才得以發生。進一步的臨床研究結果顯示,肝組織炎症活躍度更高的慢性乙型肝炎患者NTCP多呈低表達,這一特徵可能有助於患者在抗病毒治療時獲得更好的病毒學應答。

這提示我們,在急性HBV感染的病毒快速清除以及慢性HBV感染的炎症過程中,存在持續的肝細胞死亡及殘存肝細胞的代償性增殖,一方面導致了cccDNA的不斷稀釋和丟失,產生更多無cccDNA的新生肝細胞;另一方面,由於處於增殖狀態的肝細胞NTCP蛋白質膜表達水準降低,使其對HBV感染抵抗。兩個因素共同作用,有助於HBV的控制和清除。

研究二 核苷(酸)類藥物作用下產生的HBV子代病毒因DNA鏈不可逆終止而缺乏感染性

抗病毒時代以來,核苷(酸)類藥物(nucleos(t)ide analogues,NAs)被廣泛應用於慢性乙型肝炎的治療。NAs作用的主要機制是與天然核苷酸競爭性摻入正在合成的HBV DNA鏈,從而導致從頭合成(de novo synthesis)HBV DNA鏈延伸的終止和HBV病毒基因組合成被抑製。

為了探究NAs治療下子代「病毒」顆粒的感染性,該研究使用恩替卡韋(ETV)處理能穩定產生HBV病毒的HepAD38細胞,收集上清中的HBV病毒顆粒並體外感染HBV易感細胞系HepG2-NTCP,研究NAs作用下HBV子代病毒的感染性。結果顯示,NAs作用下子代HBV DNA病毒顆粒缺乏感染性。進一步的體外病毒DNA鏈延伸實驗證實,ETV的摻入導致子代病毒顆粒內新合成病毒DNA鏈的不可逆終止。

前期魯鳳民教授和竇曉光教授的合作研究已經證實,NAs作用下產生的HBV RNA病毒樣顆粒也不具有感染性。NAs作用下子代HBV DNA病毒顆粒和HBV RNA病毒顆粒都缺乏感染性,支持了現行的對高病毒載量孕婦孕晚期NAs抗病毒治療阻斷HBV感染母嬰垂直傳播措施。此外,該研究也將為通過NAs治療預防肝移植後病毒複發和阻斷HBV感染水準傳播提供新的思路。

上述兩項研究為NAs治療慢性B肝的快速應答機制提供了更為全面的解釋:一方面,肝細胞的代償性增殖可導致cccDNA不斷的稀釋和丟失,以及增殖狀態肝細胞的NTCP膜表達水準降低導致其對HBV再感染抵抗。另一方面,NAs治療下的子代「病毒」感染性的缺失進一步使HBV在細胞間的傳播和cccDNA的形成減少,同時子代病毒DNA不可逆終止不能繼續延伸,切斷了cccDNA池的內補充途徑,也加速了cccDNA的耗竭。

綜上,上述兩項研究為堅持長期NAs抗病毒治療以使cccDNA池徹底耗竭和臨床病毒學治癒帶來了新的希望。但是,我們需要明白,顯著不同於基礎研究的大膽推理與小心求證,臨床更加錯綜複雜,從概念到實踐往往有很遠的路要走。

大會現場

北京大學基礎醫學院魯鳳民教授團隊

魯鳳民教授(中),陳香梅副教授(右二)、王傑助理教授(tenure track;左二),博士研究生劉永振同學(NAs治療下HBV感染性研究;右一)和八年製博士生閆穎同學(分裂增生肝細胞NTCP表達及其對HBV感染抵抗性研究;左一)

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