新型冠狀病毒消失的中間宿主

繼229E，OC43，SARS，NL63，HKU1，MERS之後，SARS-CoV-2是已知感染人類的冠狀病毒科的第七個成員，也是最神秘的一個狠角色。

但它絕不是最後一個。

“幾千年來病毒一直生活在豬、蝙蝠、猴子體內，當人類摧毀了動物的家園，動物相繼死去，他們就得換個宿主。”——《血疫》

當蝙蝠被我們妖魔化，卻很少有人站在自然的角度審視這場“瘟疫”。

病毒學的研究使得人工乾預自然，帶來了人類進步，也帶來了陰謀論。思考人類的所作所為的同時，我們也不免要思考病毒的自然起源，而這就是本篇寫作的初衷。

在災難面前，深度的反思就是在拯救我們人類自己。

1

來自馬來的線索

前文《「新型冠狀病毒」消失的零號病人》裡，關於病毒起源，我們留下了一個懸而未決的問題：

“為什麽武漢新型冠狀病毒和SARS病毒都恰好能作用於人類細胞表面的ACE2受體？它是怎樣來到人間的？這些，都是科學家們正在追問的問題。”

恰好，就在兩天前，著名病毒進化學家Kristian Andersen在virological上發表了個人觀點，這一觀點立即被其它著名病毒學家轉載，這當中就包括哥大教授Vincent Racaniello，目前看來，這是當前最有技術含量的一篇陰謀論反駁性研究。

在這篇文章當中，Kristian提到了一個值得關注的細節，那就是關於病毒的動物宿主起源，初步分析表明，非法輸入廣東的馬來穿山甲（Manis javanica）含有一種RBD結構高度類似SARS-CoV-2的冠狀病毒。

除蛇，舟山蝙蝠，雲南蝙蝠外，穿山甲也是一個值得懷疑的對象。

華南農業大學最早提出，穿山甲可能是新型冠狀病毒的潛在中間宿主，但一直都沒有令人信服的證據，直到以下兩項研究浮出水面。

我們在前文提到過，決定病毒與ACE2結合最重要的部分，是RBD（受體結合結構域）的6個氨基酸殘基。而研究者們驚奇的發現，在所有六個S1上關鍵RBD殘基上，來自馬來西亞的穿山甲完全與SARS-CoV-2病毒匹配——這個發現令人印象深刻。

SARS-CoV-2與ACE2受體結合相對應殘基為L455、F486、Q493、S494、N501和Y505。與SARS-CoV相比較，這六個殘基中有五個在SARS-CoV-2中發生突變。儘管受體結合區的氨基酸突變來自人為的可能性幾乎不存在，但這種不常見的高度結構相似性卻令人印象深刻。

那麽，這個發現又意味著什麽呢？穿山甲真的是此次病毒爆發的罪魁禍首麽？

在給出是或者不是的判斷之前，我們似乎可以立即先給出一個顯而易見的結論：

這個證據的存在顯著降低了ACE2受體結合RBD關鍵點位來自病毒人工編輯的可能性——自然病毒的多樣性讓我們大開眼界，為什麽要人工編輯呢？

繼續觀察，我們發現，以S蛋白中第486位殘基為例，這裡有一個苯丙氨F。

按照Kristian的說法：如果人為根據ACE2受體結合的幾個關鍵殘基，通過計算生物學進行人工設計的話，該點位上的苯丙氨酸並非是最優選擇。同樣的，其它關鍵點位上預測的最佳氨基酸殘基也不是最優解。

在Kristian看來，這更像是自然選擇的結果。

既然關鍵RBD受體結構域殘基在自然界已經進行了“封裝”，這就帶來了新問題：

穿山甲與蝙蝠之間是否發生過基因重組呢？

如果認為穿山甲和蝙蝠之間發生過基因重組，重組的位置可能在哪裡？

一個獨立研究正好討論了這個問題。研究發現穿山甲冠狀病毒與SARS-CoV-2在S1-NTD亞區的序列相似性非常低，而在RBD和S2域的相似性顯著增加。

這意味著，如果假設成立，重組最有可能發生在S1-NTD和RBD交界處。

但是，用這個發現來證明基因重組的真實存在卻並不充分。原因如下：

我們在前文當中聊過，即使兩個病毒分離株具有相同的氨基酸序列，也不能得出結論讓其中一個病毒成為另一個病毒的來源。因為還存在隱性的核苷酸沉默突變，這種突變的積累，甚至可以讓兩種病毒的自然進化距離長達幾十年之久。

雖然SARS-CoV-2與穿山甲冠狀病毒在RBD氨基酸一致性水準很高，但在更深入的核苷酸水準上兩者的同源性卻並不高。如果存在上述蝙蝠和穿山甲的重組事件，這個突變事件很可能發生在遙遠的過去，而不太像是最近幾個月才發生的。

有研究人員通過對比現有數據庫當中SARS-CoV-2的93個可用完整的基因組信息（來自GISAID 189和NCBI Genbank平台）發現，並不存在明顯的核苷酸變異，這表明，在目前人體內取樣的新型冠狀病毒中，遺傳變異是有限的。人類早期樣本缺乏多樣性——這個證據強烈的表明所有這些病毒都有一個相對較新的共同祖先。

然而，多個研究都傾向於認為，這個重組事件發生在幾個月之前，而不是遙遠的過去，所以，直接認定穿山甲是中間宿主的說法，從時間上來看並沒有得到充分的支持。

儘管馬來穿山甲相比RaTG13，部分地解釋了ACE2受體突變的自然來源，但更完整的測序表明，馬來穿山甲冠狀病毒並不比雲南蝙蝠RaTG13病毒更加接近SARS-CoV-2。而且，任意兩者之間的自然進化距離也是顯而易見的。

使用目前可用的基因組序列數據對SARS-CoV-2最新共同祖先（tMRCA）的時間估計指出，病毒最可能出現在12月初（置信區間為2019年10月底至12月中旬），這與最早的回顧性確診病例相符。

而很多證據顯示，在這個時間點之後，病毒幾乎馬上就具備了人傳人的能力。我們仍不清楚關鍵突變是在那個環節發生的。

當然並非完全沒有證據，比如回顧性血清學研究有可能提供給我們信息，而且事實上已經有人進行了一些這樣的研究：

這項研究顯示，動物貿易商人對SARS冠狀病毒的血清陽性率為13%

這個研究發現，中國南部一個村莊的3%居民對這些病毒的血清陽性。

但有趣的是，武漢市200名居民沒有出現冠狀病毒血清反應性。（有人指出這個研究無法區分陽性的血清學反應是否是由以前感染過SARS-CoV或SARS-CoV-2引起的。應進行進一步的回顧性血清學研究以澄清這個問題。）

相互矛盾的證據明沒有帶給我們明確的答案。

最終，穿山甲帶給我們的新證據並沒有從根本上消除我們對病毒來源的質疑，但至少我們在自然界當中找到了藍本。雖然新型冠狀病毒的來源仍然撲朔迷離，但至少我們又稍稍遠離了陰謀論一點。

2

氨基酸的舞蹈

此前的的研究確定了，SARS-CoV-2基因組的兩個顯著的“異常”特徵突變，這也是外界病毒人工合成陰謀論的兩個支點：

1.根據結構模型和早期生化實驗，SARS-CoV-2似乎被優化以結合人類ACE2受體。

2.SARS-CoV-2的高度可變的刺突S蛋白通過插入12個核苷酸（4個氨基酸）在S1和S2邊界處帶出一個多鹼基（furin）裂解位點。這導致在多鹼基裂解位點周圍獲得O-連接聚糖。

關於第一個問題，我們已經有所洞察，那我們又該如何理解第二點呢？

我們知道，冠狀病毒基因組的後1/3很重要——包含了至關重要的編碼結構蛋白。它們包括纖突蛋白(spike，S)、包膜蛋白(envelope，E)、囊膜蛋白(membrance，M)和核蛋白(nucleocapsid，N)。

其中，E蛋白和M蛋白主要參與病毒的裝配過程，N蛋白包裹基因組形成核蛋白複合體，S蛋白則主要通過與宿主細胞受體結合介導病毒的入侵。

而S蛋白的裂解活化對病毒入侵能力以及毒力起到了關鍵作用。

對於SARS-CoV來說，S蛋白的裂解需要與受體ACE2結合引起S蛋白構象改變後才能完成。

S1球狀附著蛋白與S2纖維狀融合/進入蛋白的排列是一種非常古老的分子機器。

S1/S2複合體的出現，可能要追溯到6500萬年前發生的恐龍大滅絕事件時白堊紀/第三紀。病毒附著/融合機制可能起源於侏羅紀的某個病毒公園，從那時起在形式和功能上就一直保存下來。

為方便理解，可把S蛋白參與的膜融合過程分解成圖 2所示的6個過程：首先，S蛋白“站在”病毒表面上，融合準備狀態(A)；隨後，S蛋白受體結合域(Receptor binding domain)與細胞表面受體結合，在誘發作用下轉換為髮夾前體狀態(Prehaipin intermediate)，由非極性的融合肽（把那個三叉戟）嵌入細胞膜(B)

接下來融合過程中幾個髮夾前體在融合位點聚集(C)，最後，融合蛋白折回，轉變成緊密的杆狀三聚體髮夾(D-F)，在融合蛋白折回過程中，細胞膜與病毒膜相互靠近，細胞膜開孔後，病毒遺傳物質就可以進入細胞質開始複製。

善於折疊的S2是一種構象高度可變的蛋白質——在“變身”的同時仍然能夠保持其螺旋結構。實際上，S2至少有三種不同的結構，而不是一種：

一開始看起來像一個大棚車，隨後像“變形金剛”一樣展開形成一個機器人，向上伸手抓住一個細胞膜，然後把它拉向自己腳下的病毒膜。隨後立即彎腰，手指接觸腳趾，把兩層膜揉到一塊，將它們融合在一起。以這種方式在細胞膜表面形成的孔允許病毒物質——包括RNA基因組，進入細胞內部並開始病毒複製。

關於S蛋白的裂解，大概分為兩種情況，一種是病毒在組裝過程中， S 蛋白在弗林蛋白酶(Furin)作用下 S1/S2 之間發生裂解，裂解過程發生於宿主細胞的高爾基體上；另一種是 S 蛋白在病毒侵染時發生裂解，即S蛋白在病毒組裝過程中未發生裂解，其 S 蛋白的裂解和活化依賴於侵染過程中的蛋白酶類。

S蛋白在宿主細胞蛋白酶的作用下被裂解為S1和S2兩部分，S1主要功能是與宿主細胞表面受體結合，S2亞基介導病毒-細胞以及細胞-細胞膜融合。

恰巧，在SARS-CoV-2，在典型的S1/S2交界處存在一個獨特的強弗林蛋白酶易感位點——RRAR。Kristian認為，在S1/S2的交界區域突變出這樣的位點可以增強細胞-細胞的融合，卻並不影響病毒進入細胞。

據此有陰謀論者指出，這是人工編輯的證據之一，可事實是否如此呢？

在分析之前，我們先來談談：RRAR代表了什麽？

實際上，R和A是兩種不同的氨基酸，A代表丙氨酸，丙氨酸的體積很小，隻包含一個帶有三個原子的甲基，丙氨酸很普遍，你幾乎可以在任何序列當中看到它。

而相對比較大的精氨酸R就比較重要了，其側鏈以自由氨基結尾，給蛋白質鏈的一部分帶來正電荷。由於細胞表面帶負電，R具有天然細胞親和力。重要的是，精氨酸R可以作為常見弗林蛋白酶分解的位點。

而RRAR這個不同尋常的序列足以作為SARS-CoV-2當中S蛋白的裂解位點（S1/S2將在此裂解），RRAR是SARS-CoV-2的一個獨特特徵，於是，精氨酸R在這個關鍵部位與病毒融合/進入蛋白成熟過程中起著關鍵作用。

也就是說，突變引入RRAR弗林蛋白酶切割基序可能是SARS-CoV-2能夠在人類中複製的一個重要因素（另一個是介導ACE2結合的突變），需要得到足夠的重視。

我們知道，不同種屬冠狀病毒S蛋白是否發生裂解以及裂解時間和裂解方式相差很大。獨特的S1/S2裂解模式是SARS-CoV-2病毒在生物學上的顯著差異。

正是由於裂解模式的不同，雖然ACE2同時是SARS-CoV和SARS-CoV-2的受體，但對SARS起作用的酶的活性位點不是SARS-CoV-2的S1與ACE2分子結合位點的一部分。因此，使用可用於控制血壓的ACE2抑製劑來對付SARS-CoV-2冠狀病毒（抑製S1的結合）的預期效果可以認為很低。

無獨有偶，這裡還有一個重要的發現：

除了兩個鹼性精氨酸（R）和一個在切割位點的丙氨酸外（A），RRAR之前，還插入一個脯氨酸（P）；與近似冠狀病毒比較，這個SARS-CoV-2特有的全新插入的序列其實是PRRA。

脯氨酸P的作用是，可以讓主鏈原子被環化成環狀結構。

由於脯氨酸的兩端不是圍繞每個主鏈鍵自由旋轉，而是彼此鎖定成130度角，因此脯氨酸在蛋白質鏈的關鍵部位產生扭結。

正是它的插入產生的轉角結構，導致S673，T678，S686發生添加O-糖基化。

這又是什麽意思？

我們知道，絲氨酸S和蘇氨酸T都是羥基化氨基酸（-OH）。除了容易與水相互作用外，它們也可能將多糖化合物添加到蛋白質鏈中，即所謂的O-糖苷鍵，這意味著將糖衣覆蓋到蛋白質該區域，從而屏蔽S蛋白上的潛在表位或關鍵殘基。而Kristian也提到，關於這個結構的潛在功能我們還並不清楚。

如上圖所示，資深微生物學和分子遺傳學專家William R.Gallaher博士曾經提到，在S2的左側，與S1的交界處附近描繪了一組黑色球。它們表明這一組S殘基被認為是O-糖基化的可能位點，這將傾向於形成糖衣並保護S2蛋白的融合肽基序周圍的區域。

之前的經驗表明，糖基化是最豐富和最多類型的蛋白翻譯後修飾。這種修飾形式能調節蛋白質的結構，穩定性和功能，並在大多數生物過程中起到廣泛，且高度特異的作用。

而在14個氨基酸長度的一段短短的序列上，同時出現了兩個精細的功能性結構突變：插入RRA帶來的RRAR裂解點位，以及插入脯氨酸P引發的O-糖基化。是很難通過體外細胞培養來實現的——這至少降低了人工實驗室培養病毒的可能性。

而且，突變帶來O-糖基化，通常意味著免疫系統的參與，而這種免疫系統在體外細胞環境是不存在的。

同時，Kristian還認為，通過動物體內自然進化產生的可能性雖然很低，但也不是不可能。畢竟一些人類beta冠狀病毒，比如HCoV-HKU1，都具有多鹼基的裂解位點，以及在S1/S2裂解位點附近預測的的O-連接聚糖等特徵。

大自然作為巨大的病毒庫，為我們提供了先例。

穿山甲冠狀病毒的研究發現，其中不包含弗林蛋白酶切割位點RRAR。

這也許意味著其他中間宿主記憶體在的可能性——病毒可能在這些宿主上形成了弗林蛋白酶切割位點，之後傳播給人。

如果這個假設成立，按照Kristian的看法，這種中間宿主體內的病毒進化為新型冠狀病毒，需要具備兩個前提條件：

此中間動物宿主具有極高的密度，這樣自然選擇突變才能迅速發生。

此中間宿主有與人類基因同源的ACE2基因。

當然，我們並沒有排除中間宿主是Manis javanica馬來穿山甲之外的其它種類的穿山甲的可能，只是因為我們缺少對其它種類穿山甲物種的信息采集。在穿山甲和其他可能攜帶SARS冠狀病毒的動物身上進一步鑒定冠狀病毒仍然是一項重要的任務。

如果病毒不是在中間宿主體內進化為新型冠狀病毒的話，Kristian也提出了另一種可能：多鹼基切割位點插入也可能發生在人與人之間的傳播過程中。當然，需要特定的插入或重組事件才能使SARS-CoV-2作為一種流行性病原體出現。

按照這個思路推演，在人傳人實現之前，早期人畜共患病期間的情況，基本上相當於阿拉伯半島上MERS-CoV爆發的情況，在那裡，所有的人類病例都是由於從駱駝身上的病毒對人產生單一感染或短鏈傳播。經過8年對2499例病例的治療，病毒還沒有出現一種人傳人的進化突變。

而我們唯獨缺乏對這一階段的早期發現。

最終，Kristian總結了他對於SARS-CoV-2起源看法的兩個可能性：

1.在人畜共患傳染病轉移之前在非人類動物宿主中的自然選擇

2.在人畜共患傳染病轉移之後在人類中的自然選擇

如果是前者，SARS-CoV-2預先感染了另一種中間宿主，那麽我們花費了巨大的代價控制了當前流行病的人-人傳播，病毒也有可能在未來再次通過動物傳播給人類。

如果是後者，如果我們所描述的突變過程發生在人類身上，那麽即使我們重複了人畜共患病，除非重新發生相同的一系列突變，否則同樣的病毒在將來也不太可能爆發。

以上的兩種可能性，哪一個更可能發生？你又更希望哪一個會發生？

3

不可知的大自然

我們來匯總一下已知的事實：

SARS-CoV-2可能在細胞培養的傳代過程中獲得RBD突變位點，這在以下的兩項研究當中已經被證實。

關於多鹼基裂解位點的研究顯示，在低致病性禽流感病毒在細胞培養或動物中長時間傳代後，也觀察到新的多鹼基裂解位點。比如雞Newcastle病毒的一個無毒分離物在雞的連續傳代過程中，通過在其融合蛋白亞基的連接處逐漸獲得一個多鹼基裂解位點而變得高度致病。

但O-連接聚糖的獲得（如果是功能性的）否定了前兩點的可能性：O-連接聚糖的產生通常意味著免疫系統的參與，而這種免疫系統在體外細胞培養環境下是不存在的。

在前文當中，我們已經基本排除了病毒人工基因編輯的可能。

Kristian認為，SARS COV-2不可能通過現有的SARS相關冠狀病毒的實驗室操作而出現，遺傳數據也顯示，SARS-CoV-2並非來自任何先前使用的病毒主乾。

再結合以上三點證據，似乎唯一比較可行的通過細胞培養或動物傳代途徑，人為有意識製造SARS-CoV-2的方法是：

事先分離具有高度遺傳相似性的前體病毒。隨後產生的多鹼基裂解位點需要在細胞培養中或具有與人類相似的ACE-2受體的動物（如雪貂）中進行密集的傳代。

當然，在證明或證實以上猜想之前，我們仍然沒有排除故意洩露或無意洩露SARS-CoV-2的可能性（如果這種病毒真的能夠按照這種方式被有意識地培養出來的話）。

為了最終確定病毒的來源，我們仍然需要更多法醫學，分子病毒學，基因組學，流行病學的證據給出嚴肅和嚴密的證明，但識別零號病人和早起病例（包括與武漢海鮮市場無關的病例），或直接的動物源並從中獲得病毒序列將是揭示病毒起源的最確定方法。

大自然製造病毒的想象力遠遠超越了人類有限的認知，那些訴諸陰謀論的人們，往往卻忽視了自然的博大和神奇。

《湮滅》片中，文崔斯博士臨死前說：

“它跟我們不一樣，我不知道它想要什麽，或者是它是不是想要。”

讓人類恐懼的並不是病毒本身，而是大自然的無意識創造病毒的不可知的力量。

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