撰文 | 亦初責編 | 兮三羧酸循環是三大營養素（糖類、脂類、氨基酸）代謝的共同通路，也是糖類、脂類、氨基酸合成和轉化的樞紐。ATP-檸檬酸裂解酶（ACLY）是連接葡萄糖分解代謝和膽固醇、脂肪酸合成代謝過程中最為關鍵的酶（圖1）【1】，在ATP和輔酶A（CoA）存在下能催化細胞質中的檸檬酸生成乙醯輔酶A和草醯乙酸。我們知道乙醯輔酶A不僅是膽固醇和脂肪酸從頭合成的重要原料，還是蛋白質乙醯化修飾反應的底物。
有意思的是ACLY在肝癌、結直腸癌、肺癌、攝護腺癌、膀胱癌和胃癌等多種癌症中蛋白表達量增加，敲低或抑製ACLY的酶活可使癌細胞生長受阻，因此乙醯輔酶A的代謝調控有望成為腫瘤治療的又一手段（詳見：Cell Metabolism丨欽倫秀團隊揭示乙醯輔酶A代謝在肝癌轉移中的重要作用）。由此可見ACLY是抗腫瘤葯和降脂葯的重要靶點（圖2）。自1990年就開始開發ACLY抑製劑，然而僅有用於高膽固醇血症治療的Bempedoic acid進入了臨床III期【2】。我們知道蛋白質的三維結構是靶向藥物設計的基礎，但ACLY全酶四聚體的結構仍未取得突破。
近日，來自美國哥倫比亞大學大學生物科學系的Liang Tong團隊和比利時根特大學（比利時學術排名第一的綜合性研究型大學）生物化學與微生物系的Kenneth Verstraete團隊分別在Nature上發表了題為An allosteric mechanism for potent inhibition of human ATP-citrate lyase和Structure of ATP citrate lyase and the origin of citrate synthase in the Krebs cycle的研究工作，他們報導了ACLY全酶四聚體的三維結構，設計出了高親和力的變構抑製劑，並揭示了還原型和氧化型三羧酸循環中檸檬酸合酶的演化。
結構域1能結合CoA、結構域2中的His760磷酸化是催化反應的關鍵位點、結構域3和4形成的ATP摺疊能結合ATP、結構域5能結合檸檬酸、而位於羧基端的結構域6氨基酸序列與檸檬酸合酶（CS）則有微弱的同源性。480kD的ACLY蛋白複合物是由同四聚體組成，整個檸檬酸裂解反應經由四步催化完成（圖4）。
早先隻解出了前五個結構域（1-820個氨基酸）的結構，但它不能形成四聚體，也沒法完成檸檬酸裂解完整的反應，得到的結構信息有限。Liang Tong團隊和Nimbus Therapeutics（專註於研發代謝紊亂、腫瘤和免疫等疾病的小分子藥物）公司篩選到人類ACLY高親和力的抑製劑（2-羥基-N-芳香基苯磺醯胺類，NDI-091143半抑製濃度IC50為2.1 ± 0.3 nM，之前的抑製劑如2-hydroxy-N-arylbenzenesulfonamides IC50為130 nM）。發現該化合物能顯著提高ACLY蛋白全長或N端蛋白（1-820aa）的穩定性。接著他們用冷凍電鏡技術cryo-EM解析了ACLY全酶四聚體的三維結構，總體解析度3.67埃，N端片段結構解析度為4.11埃，四聚體的結合中心解析度更是達到3.2埃（圖5）。
圖5 ACLY全酶的四聚體結構
通過結構可以看出ACLY四聚體是通過催化中心結構域CS（citryl-CoA轉變成OAA和乙醯輔酶A）的α螺旋緊密結合形成了四個原聚體，蛋白N端位於外圍；Citryl-CoA在一個原聚體N端檸檬酸和CoA結合結構域形成，然後轉位到另一個原聚體CCLY活性位點完成催化反應，該結構也解釋了ACLY只能在四聚體形式才能完成整個反應的原因。通過結構分析發現NDI-091143結合在ACLY的檸檬酸結構域（上圖標藍色的結構域5部分）的疏水小室中（與檸檬酸的結合位點不同），有意思的是該結合使ACLY產生了變構效應，結合後結構發生了較大的變化，使得Ile344的側鏈移動約6 埃，這正好位於檸檬酸結合位點，從而阻斷了檸檬酸的結合；識別檸檬酸的Arg379胍基移動了約12 埃，使其不能識別檸檬酸，從而使檸檬酸不能與ACLY結合。在複合物中NDI-091143與檸檬酸結構域有廣泛相互作用，如酚羥基氧原子與Gly380的醯胺N形成氫鍵，磺醯胺的醯胺基團與Arg378的羰基形成氫鍵，三個苯環與ACLY形成廣泛的范德華相互作用。該機制的發現極大地增強了ACLY的可成藥性，為開發治療癌症和代謝紊亂的藥物提供奠定了堅實的基礎。Kenneth Verstraete團隊解析了自養生物如泥生綠菌（C. limicola，分布於無氧、含硫化氫的水體中呈桿狀、卵狀或弧狀、不運動和不放氧光合的細菌）和嗜熱棲熱菌（H. thermophiles，能在45℃或45℃以上，pH值在3.0以下的環境中生長能氧化亞鐵、元素硫、還原態無機硫化物和硫化礦物的耐熱嗜酸細菌），古菌選如產甲烷菌（M. concilii，能夠將無機或有機化合物厭氧發酵轉化成甲烷和二氧化碳的古細菌），異養生物如人類ACLY的晶體結構（圖6）。
三羧酸循環分為自養生物的還原型（三羧酸循環逆向進行，將二氧化碳中的碳原子還原為有機物）和異養生物的氧化型（把有機物碳原子氧化成為二氧化碳）（圖7）。
兩篇文章各有亮點，第一篇用冷凍電鏡解析了新開發的ACLY強效小分子抑製劑的結合位置及機理，這給在低解析度的電鏡結構中識別小分子提供了一種強有力的方法；第二篇文章則用傳統的晶體學方法解析了ACLY的結構，並明確了檸檬酸合酶(CS)檸檬醯-CoA裂解酶（CCL）的演化關係，為氧化型三羧酸循環的演化提供了新的見解。製版人：珂
參考文獻
1.Pinkosky SL, Groot P, Lalwani ND, Steinberg GR: Targeting ATP-Citrate Lyase in Hyperlipidemia and Metabolic Disorders.2017, 23,1047-1063.
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