中國學者構建新冠病毒假病毒系統，揭示其入侵細胞過程

新冠病毒引發的疫情已經在全球範圍內爆發，目前確診感染人數已經超過100萬，並且這一數值還在持續猛增中。隨著人們對SARS-CoV-2的認知越來越清晰，科研人員必將開發出有效的治療藥物和疫苗。

病毒複製周期可劃分為吸附、侵入、脫殼、病毒大分子的合成以及病毒的裝配與釋放五個階段，其中，病毒入侵細胞過程是十分關鍵的一步。但是，直接用病毒毒株進行研究，需要實驗室安全級別達到三級以上，這極大地限制了新冠病毒研究，因此科研人員構建了假病毒。假病毒只能感染一次細胞，安全性高，能夠模擬病毒入侵細胞的過程。

義翹神州假病毒中和檢測原理示意圖

近日，中國醫學科學院/北京協和醫學院病原生物學研究所的研究人員在國際頂級學術期刊Nature的子刊Nature Communication上發表題為——《Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entryand its immune cross-reactivity with SARS-CoV》的研究論文。此項研究構建SARS-CoV-2 S蛋白假病毒系統和293T的hACE2穩轉細胞系，以此確定SARS-CoV-2的易感細胞系、病毒受體、侵入途徑和蛋白酶激活，揭示了SARS-CoV-2入侵人體細胞的具體分子過程。

義翹神州構建的新冠病毒S蛋白假病毒系統與此相似，同樣能夠侵染hACE2過表達的293T細胞。

已有研究表明，冠狀病毒通過表面的刺突蛋白（S蛋白）與受體結合，從而介導膜融合和病毒入侵。S蛋白含有兩個亞基——S1和S2，且S1的N端和C端可劃分為兩個獨立的結構域——NTD和CTD，兩者均可作為受體結合域(RBD)。

SARS-CoV和MERS-CoV都是用CTD來結合它們的受體——人血管緊張素轉換酶2（hACE2）。值得注意的是，已有研究報導，SARS-CoV-2與SARS-CoV在S蛋白的氨基酸同源性上較高，且同樣也以hACE2作為受體。

根據病毒株和細胞類型不同，S蛋白可被一種或幾種宿主蛋白酶切割，包括弗林蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、跨膜絲氨酸蛋白酶2/4(TMPRSS-2/4)和人氣道胰蛋白酶樣蛋白酶(HAT)。然而，這些蛋白酶能否促進SARS-CoV-2進入細胞仍然是難以捉摸的。

研究人員利用SARS-CoV-2 S蛋白假病毒系統，篩選了一組人和猴細胞系，證實人血管緊張素轉換酶2(hACE2)是SARS-CoV-2的受體，並在293T/hACE2細胞系中發現SARS-CoV-2主要通過內吞作用進入細胞。

研究人員還通過實驗證明組織蛋白酶L是SARS-CoV-2 S蛋白激活的關鍵，胰蛋白酶能夠誘導大的合胞體形成。此外，研究者還證實阻斷PIKfyve和TPC2可以強烈抑製S蛋白介導的入侵過程，這表明PI(3,5)P2信號通路可能是SARS-CoV-2 感染的潛在藥物靶點。

該研究還證實SARS-CoV-2的S蛋白不如SARS-CoV的S蛋白穩定。此外，雖然SARS-CoV-2與SARS-CoV在S蛋白的氨基酸同源性上較高，但SARS S1蛋白的多克隆抗體——T62（購自義翹神州），僅能抑製SARS-CoV S的進入，而不能抑製SARS-CoV-2 S蛋白假病毒進入細胞。進一步的研究表明，SARS和COVID-19患者的恢復期血清僅顯示有限的交叉中和，這意味著感染SARS的康復患者並不足以對SARS-CoV-2產生抵抗力。

總而言之，此項研究通過構建SARS-CoV-2 S蛋白假病毒系統和293T的hACE2穩轉細胞系，發現SARS-CoV-2主要通過內吞作用進入人體細胞，而PIKfyve、TPC2和組織蛋白酶L在這一過程中發揮關鍵性作用。

利用假病毒系統將有助於SARS-CoV-2的藥物和疫苗的研發。義翹神州構建的SARS-CoV-2 S蛋白假病毒系統使用HIV-1為基礎載體轉染293細胞，能夠表達S蛋白，並攜帶熒光素酶報告基因。使用假病毒模擬抗體阻斷病毒進入細胞的生物過程，檢測抗體或血清對假病毒是否具有中和活性。

義翹神州新冠假病毒中和檢測服務平台，採用自主構建的SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike假病毒（PSV001）和ACE2過表達293T細胞系（OEC001），安全性高、可操作性強，已成功對抗體/血清進行中和能力評價。同時，義翹神州還可以開展SARS-COV、MERS-COV、流感病毒等研究的假病毒包裝及中和檢測服務。

義翹神州假病毒中和檢測數據示例

假病毒抗體中和檢測

假病毒血清中和檢測

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參考資料：

[1] Xiuyuan Ou et al., (2020), Characterization of spike glycoprotein ofSARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV. NatureCommunication, DOI:10.1038/s41467-020-15562-9.

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