肝纖維化和肝硬化逆轉的組織學評價

鄭永見， 汪艷

器官衰竭防治國家重點實驗室

廣東省肝纖維化工程技術研究中心

南方醫科大學肝病研究所

肝纖維化發生是慢性肝組織損傷病理進展的共同通路。了解肝纖維化演變特徵，對於預測主要慢性肝病臨床病程重要終點，確定及時有效的臨床管理方案等都有重要價值。隨著慢性肝病治療學的不斷進步，除了判斷肝纖維化的分期，評價肝纖維化的變化特徵也成為臨床治療決策重要的考慮因素。可量化分析和可反映動態變化已成為對目前纖維化評估技術的重要需求。

近40年來，臨床肝纖維化評估方法的研發報導持續不斷。簡單地從技術角度可以將這些研發技術分為「有創」和「無創」兩大類。「有創」是指需要使用肝臟組織的評估方法；而不需要使用肝臟組織的「無創」方法則包括成像工具、血清標誌物以及基於人體測量學、分析形態學和（或）人口統計數據的模型等。不同評估方法在可靠性、精確性、操作過程、成本效益、臨床驗證程度等內在和外在因素方面存在不同特點，因而也就決定了它們有不同的應用特點。本文主要目的是回顧、分析和討論「有創」的組織學檢查在當前慢性肝病管理和臨床研究中評價肝纖維化/肝硬化及其逆轉的應用價值及研發方向。

1 當前慢性肝病管理有關肝纖維化評價的幾個話題

1.1 慢性丙型肝炎（CHC）

長期以來，慢性病毒性肝炎（主要包括HBV和HCV感染）被認為是一類以病毒感染和纖維化相關肝臟併發症為特徵的疾病。有不少研究工作比較系統地分析了CHC的肝纖維化自然史。經典的原創性工作，如Poynard等對2235例法國CHC患者肝活組織進行了回顧性橫斷面研究，發現在疾病進展中的CHC患者，纖維化程度而非炎症水準會隨著感染持續時間而遞增；隨著纖維化的進展，肝細胞癌（HCC）發生的風險也會迅速增加。經抗病毒治療，相對於非持續病毒學應答患者，持續病毒學應答（SVR）患者更有可能在6個月至5~10年出現肝纖維化/肝硬化消退。目前，使用直接抗病毒藥物（DAA）已經可以使90%以上的CHC患者在有限時間內實現病毒學治癒，因此病毒學治癒後的肝病終點事件如何變化成了進一步的重要話題。一項針對933例受試者的前瞻性研究利用FibroTest和FibroScan重複測量10年肝纖維化數據，觀測了肝纖維化逆轉。該研究發現經病毒學治療，肝纖維化緩慢消退，肝硬化病例減少5％，原發性肝癌風險仍為5％，表明即使在獲得SVR後也不應忽視纖維化相關的肝病問題。作者近期對3243例CHC患者經干擾素治療獲得SVR後的組織學纖維化變化數據進行了Meta分析，發現雖然獲得SVR者發生纖維化改善的概率大大增加了，但是約有40%的獲得SVR者其纖維化程度在3年內可能改善不明顯。而較早前一項研究對HALT-C研究隊列的患者數據進行了分析，發現組織學纖維化變化數據與肝臟相關臨床結局有顯著相關關係。最新基於DAA-SVR的臨床數據也提示，基線嚴重肝纖維化或肝硬化是獲得SVR後半年或之後發生HCC的獨立危險因素。因此可見，肝纖維化評價仍然是目前CHC患者臨床管理的一個重要參考內容。

1.2 慢性乙型肝炎（CHB）

CHB的臨床病程由HBV慢性感染和肝臟病變交織而成。感染者從慢性肝炎向肝硬化進展速度的個體差異很大。肝纖維化、肝硬化在CHB相關主要臨床不良事件中起關鍵作用，目前全球HCC病例仍大部分出現在HBV相關肝硬化患者中。此外，肝組織結構的瘢痕變形會嚴重損害肝細胞功能，導致肝臟失代償。持續抑製HBV複製能夠有效降低肝硬化和HCC發生的風險，改善慢性HBV感染的臨床進程，但無法消除肝硬化或HCC。臨床研究對如何預測已經發生持續病毒學抑製CHB的嚴重肝病事件也非常重視。最新發布的基於PAGE-B隊列中5年以上有效抗病毒治療1427例CHB患者的分析數據提示，基線年齡和嚴重肝纖維化/肝硬化是開始治療5年以後出現HCC事件的最主要獨立危險因素。並且臨床指數如PAGE-B評分獨立於Ishak評分在預測相關危險度方面似乎有更良好的表現。以上表明，肝纖維化評估對CHB患者臨床管理至今仍有重要影響。

1.3 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）

NAFLD正成為全球範圍患病率最高的慢性肝病。雖然NAFLD表型相關的病理髮生機制具有突出的異質性，但其臨床進展表現通常比較緩慢。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）較單純脂肪肝（NAFL）發展成肝硬化以及HCC等的風險會顯著增加。但有些研究也發現，一定比例的NAFL患者也可以進展為有顯著纖維化的NASH，並且纖維化進展的發生率可能與NASH患者相當，這表明在伴隨著代謝狀況惡化的情況下，NAFL也許不完全是良性病程。目前明確診斷NASH仍依賴於肝活組織檢查，其組織學特徵包括不同程度的肝脂肪變性、小葉間和（或）匯管區周圍炎症、肝細胞氣球樣變，以及纖維化，這些組織學特徵有助於提示個體所處的疾病階段。最新基於來自美國NASH臨床研究網路（NASH CRN）兩項新葯研究PIVENS和FLINT隊列的組織學數據表明，NASH、細胞損傷和脂肪變等程度與纖維化變化顯著且密切相關，提示這些組織學參數對於臨床動態觀察都有一定價值。有不少研究發現在所有這些組織學特徵描述中，纖維化是預測NAFLD嚴重預後事件的最強獨立因素。NAFLD患者中的纖維化演變速度也存在較大差異，如一組270例早期NAFLD患者進行連續活組織檢查，16％的患者可能在4.4年內進展為橋接纖維化。除纖維化指標之外，目前似乎沒有其他組織學或非組織學指標能夠更可靠地預測NAFLD患者的嚴重臨床事件。

1.4 酒精性肝病（ALD）

酒精相關肝硬化佔全球肝硬化死亡的一半，ALD也是全球主要疾病負擔之一。ALD可以包括一系列臨床和病理學變化包括脂肪肝、酒精性肝炎（AH)、肝硬化及其併發症等。自然史觀察研究發現每年大約3% AH患者進展至肝硬化。疾病進展危險因素包括大量飲酒、存在脂肪性肝炎、共患病毒性肝炎、肥胖、吸煙、女性、某些遺傳因素等。嚴重AH（MELD＞20或MDF≥32）或肝硬化併發症常常是ALD初現臨床的突出表現，30 d病死率約20%~50%。儘管依據臨床病史和生化表現可以進行臨床診斷，AH診斷的標準仍是肝活組織檢查。這對於指導目前臨床治療如使用糖皮質激素等有重要參考意義。AH的典型組織學表現涉及肝細胞脂肪變和損傷類型與程度、炎性反應細胞種類與分布、纖維化分布與程度、膽汁淤積、膽管反應等各方面。其中，肝纖維化是患者中長期嚴重預後的獨立危險因素之一。如何確認和應用有效的疾病進展標誌物是ALD治療學實踐和研發目前面臨的主要問題之一。

1.5 其他

除了上述主要幾種慢性肝病之外，混合病毒感染或混合病因的肝纖維化病程可能更複雜和更具進展性。由於其他臨床指標如病因學、肝功能檢查或組織學炎症程度等，可能不足以可靠區分個體患者的預後，因此常常應用纖維化水準來輔助臨床決策。類似情況如藥物性肝病、遺傳性肝病、自身免疫性肝病等診斷也都需要基於各自臨床自然史特徵的肝纖維化評價方法。

2 組織學評價系統

2.1 半定量評分

迄今為止使用最廣泛的評分體系，包括用於評估慢性病毒性肝炎纖維化的Knodell、Ishak、Scheuer/Batts-Ludwig/Tsui和METAVIR系統，以及NASH評分系統，如NASH CRN系統的纖維化評分或歐洲FLIP病理論壇提出的SAF（脂肪變性、炎症活動、纖維化）評分，都採取了半定量評估方式。這些評分系統大多數是在尚缺乏有效治療的情形下建立的，因此構建這些評分系統的基本思想是基於對病程進展中組織學特徵的觀察。此外，多年前肝硬化大多被視為無法治癒的終末期肝病，肝硬化動態變化的概念不在評估範圍，因此將肝硬化簡化為1或2個階段。這些系統多使用從0~4或0~6等5~7個等級序數來分類從無纖維化到肝硬化的整個過程。使用較多等級序數的系統可以提供纖維化階段的更多細節，但是與使用較少序數的系統相比，其評分的重複性可能略會降低。

需要指出的是，纖維化分布模式是這些半定量評估系統所對應的描述對象，其預測價值已在臨床實踐和研究中得以不同程度的驗證。病因因素對纖維化分布模式的多樣性有明顯影響。如慢性病毒性肝炎的特徵表現為匯管區周圍的改變，纖維化分布模式從匯管區域開始，向肝界板擴張，出現橋接纖維化，最終形成結節性肝硬化；而在成人NASH或AH，典型的纖維化分布初現於中央靜脈區周圍，即肝腺泡Ⅲ區。值得注意的是，儘管評估系統的種類不斷增加，但仍然缺乏涉及混合病因慢性肝病所導致的匯管區和中央靜脈區周圍變化的評估系統，例如HCV合併NASH或HBV合併AH等。

為了解決對肝硬化進一步評估的問題，還有一些評分系統，如Laennec′s評分系統，Kumar等和Nagula等研究者建立的評估方法等，將肝硬化又細分為2~3階段。這些評分系統依據了肝硬化的分布特徵包括纖維化區域、結節數、結節大小和纖維間隔寬度等。這些分期與臨床顯著門靜脈高壓以及肝臟相關事件發生有顯著相關關係。

充足的標本大小是影響組織學檢查評估準確性的核心問題。不同病因可能對樣本大小標準有不同要求。在臨床允許的採樣尺寸下，活檢組織越大，樣本的預測性越好。但實際上，與不同評分方法間產生的差異相比，這些差異似乎顯得微不足道。除了樣本大小問題，簡易性、觀察者內及觀察者間的變異係數、方法的準確性和可重複性也會對診斷結果產生較大影響，尤其是在使用半定量評分系統的情況下。因此針對不同應用情況，需要綜合考慮以上因素，來選擇最合適的評分系統。同時應當注意，為了避免解讀失誤，需要專門注釋，清楚說明所採用的評分系統。

儘管半定量評分系統目前被作為指導臨床實踐、試驗評估、無創性或其他有創性評估工具研發的參考標準，但這些系統不是理論意義上的完美金標準。該系統在方法學方面的固有缺點是顯而易見的，如精度不足（相同分期內的纖維化進展程度會有明顯不同，但無法在分期數值上體現這些不同）、缺乏線性（各分期之間並非相等的疾病程度或纖維化程度的間隔）、主觀性（讀片者對各分期的判斷有不同程度的差異）、單向性（分期所指的特徵裡沒有關於纖維化消退的內容）、術語模糊（描述性的專業概念）以及無法普遍適用（需要考慮不同病因等因素選用不同評價方法）等。隨著對主要慢性肝病的治療和機制理解的加速進步，這些局限似乎正在成為治療學研發過程的技術困難。

2.2 定量膠原面積

膠原纖維是肝纖維化結構的主要成分，通過準確地測量膠原纖維參數能夠反映肝纖維化程度。從技術上講，膠原纖維測量是否準確有兩點決定因素，首先目標膠原纖維是否與疾病纖維化有關，其次是應用的測量工具是否可以線性反映選定區域的膠原纖維特徵。一般情況下，診斷工具的構建從根本上來說是針對這兩點的不同解決方案的組合。膠原纖維面積（CA）作為纖維化測量參數，其與疾病纖維化的相關性在大多數臨床研究中已得到驗證。在1985年Jimenez等發表的首次相關研究中，組織天狼星紅染色被證實可以顯示膠原纖維以進行CA測量。隨著時間的推移，成像和分析技術不斷改進以及多樣化，但是CA測量的基本概念幾乎保持不變。關於CHC、脂肪性肝炎等慢性肝病患者的量化組織學纖維化評估，至今大多數臨床試驗仍多採用CA測量。CA測量過程的基本技術策略包括先確定灰度閾值以及之後的識別、檢測和計算。此步驟取決於互動式調整，由此可能導致不同研究報告之間的測量數值存在比較大的差異。另有研究指出，儘管CA數值與半定量評分之間存在統計學相關性，但相關性僅限於那些評分較高的數據。這可能歸因於取樣對纖維化比例變化的影響，或者由於半定量評分系統的早期分期原則與纖維膠原含量並沒有太多相關性；另外，圖像質量也可能是影響早期階段纖維膠原評估的因素。到目前為止，CA在臨床試驗或基礎研究中主要用於揭示群體纖維化程度的進展或改善。

2.3 定量膠原分布特徵

目前已經認識到纖維化組織的含量和分布特徵在不同疾病存在差別，並與臨床預後相關。肝臟組織包含了有關纖維化的所有原始和直接信息，因此作者研究組首次提出理論假設—定量肝組織膠原纖維分布特徵（CP），也許可以發現更多關於纖維化變化特徵的信息。驗證該假設的首要步驟是有效和準確地從肝組織中獲得纖維化分布特徵的信息。實際上，一直以來定量CA研究也不同程度地面對過這個問題，相關研究經驗表明，識別膠原纖維的常規組織學技術可能會損害檢測分辨的靈敏度。目前多光子、高光譜等顯微成像技術被相繼開發應用於生物組織纖維化分子識別。這些顯微成像技術的共同特點是可以選擇性地收集靶分子如膠原蛋白分子、煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸分子等的自發熒光發射光譜信號作為其組織成像特徵；意味著觀察樣本無需任何特異性染色，有力提高了圖像信息的準確性。通過這些新型技術的高質量上遊圖像採集，圖像分析程序可以在更大程度上避免成像相關人為因素的偏差，將原始圖像數據進行有效二進位變換以方便圖像分割、定義、識別和分析等處理過程。然而與傳統光學顯微鏡相比，這些相對高級成像技術的應用局限也是顯而易見的。其成本相對較高，需要進一步臨床驗證，並且目前在常規臨床實驗室的可及程度低。

CP測量與CA測量相比的理論優勢在作者系列臨床轉化研究中已得到初步證實，包括更易於忠實地模擬序數評分，更準確地區分相鄰纖維化分期和肝硬化分期，以及減少樣本尺寸的變異性等，其臨床意義值得進一步觀察。

3 肝纖維化/肝硬化改善的組織學評價

組織肝纖維化/肝硬化是纖維化基質過度沉積的結果，具有動態特徵，可以發生自發或經過治療乾預後的改善消退。前文分析可知，纖維化是目前已知的主要慢性肝病最重要的預後危險因素之一，因此肝纖維化/肝硬化改善是治療學研究和實踐的主要觀察指標。對此，臨床治療學研究目前普遍採用的基本評判方法是，對乾預前後肝活檢樣本使用目前公認的半定量評價系統進行評分，通常將纖維化評分前後沒有變化或者降低不少於0或1分值作為慢性肝病治療有效的重要替代終點和評價依據。

如何更有效地評估肝纖維化/肝硬化逆轉，雖然早前有病理學文獻詳細描述了進展與逆轉慢性肝炎纖維化形態學特徵與區別，但針對於慢性病毒性肝炎逆轉評估的新方法最近才由Sun等首次建立。該研究提出了一套包括進展型、逆轉型以及中間型的形態特徵定義和分類的系統方法，並將分類系統在71例CHB患者經抗病毒治療前後的肝活檢樣本進行了驗證。該方法對於評價CHB患者治療後的組織學改善可能具有重要價值。

肝硬化是慢性肝病管理內容中的重要節點，精準的診斷和評估對改善早期代償性肝硬化治療具有重要的臨床意義。作者在新近一項研究中基於測量纖維化膠原分布特徵的方法學策略，即定量CP策略，初步建立了可以精確描述肝硬化特徵組織學組成的新工具，經動物模型和CHB隊列初步驗證可以實現對肝硬化動態重構的準確描述。此外，作者通過觀察CHB EFFORT隊列抗病毒治療前後縱向組織學變化數據發現，基於定量CP策略的測量結果與Ishak纖維化評估對於纖維化逆轉率分析結果是一致的。這些初步研究都無疑為分析評估肝纖維化/肝硬化改善提供了新思路，值得進一步驗證。

4 總結

肝纖維化相關臨床問題一直備受關注，即便是在慢性肝病治療學正在飛速發展的當下，依然有很多話題有待探索。肝纖維化反覆被臨床研究證實為慢性肝臟疾病預後的主要獨立危險因素。因此我們可以清楚地認識到，解決肝纖維化問題雖然還面臨很多任務，但也值得研究者們加倍努力。在組織學評價方面，除前文中提出的問題之外，還有，如其他常見慢性肝病的肝纖維化評價方法與臨床意義探尋，如何將組織學檢查與無創方法有效配合提高預後分層的有效性和可行性等，也都是研究者們正在不斷努力的方向。關於肝纖維化評估，組織學檢查顯然不是完美標準，在一些臨床情況中其應用也正在或者將被日漸成熟的現代無創技術方法所替代，但是隨著醫學工程學等交叉學科技術不斷進步，肝臟組織本身所特有的信息內涵和臨床意義會將得到進一步理解和發掘。對於臨床實踐，其新的輔助意義也值得不斷探索。

引證本文：鄭永見, 汪艷. 肝纖維化和肝硬化逆轉的組織學評價[J]. 臨床肝膽病雜誌, 2019, 35(4): 709-713.