科學家利用「人造精子」技術實現蛋白質重要氨基酸的個體水準遺傳篩選

近日，國際學術期刊《自然-細胞生物學》（Nature Cell Biology）在線發表了中國科學院生物化學與細胞生物學研究所李勁松和陳勇研究組的最新合作研究成果「CRISPR–Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development」。該工作利用最新的CRISPR/Cas9介導的單鹼基編輯系統 (BE3) 結合單倍體胚胎乾細胞（「人造精子」）介導的半克隆技術，對影響小鼠原始生殖細胞（PGCs）發育的重要基因Dnd1實現個體水準氨基酸功能位點的遺傳篩選。

CRISPR/Cas9基因編輯系統利用Cas9核酸內切酶結合sgRNA對靶DNA進行切割，誘發DNA進行非同源末端連接（Non-homologous End Joining，NHEJ)或同源重組（Homology-directed repair，HDR）損傷修復機制，進而實現靶基因序列突變。2016年，David R. Liu課題組建立了基於CRISPR/Cas9技術的高效誘導單一核苷酸突變的胞嘧啶單鹼基編輯器（BE3），通過nickase Cas9蛋白（nCas9）上偶聯大鼠胞嘧啶脫氨酶（rAPOBEC1），可以將靶位點C？G轉變為T？A（Komor et al., 2016, Nature）。由於該系統避免了傳統CRISPR/Cas9導致DNA雙鏈斷裂可能帶來的損傷，迅速被國內外科學家應用於不同物種的基因編輯。單鹼基編輯系統除可以進行單個氨基酸位點的基因編輯以外，理論上還可以通過氨基酸位點的遺傳篩選進行蛋白結構和功能的在體研究，不過該應用至今未見報導。

李勁松研究組長期從事小鼠孤雄單倍體胚胎乾細胞及其應用的研究。2012年，李勁松研究組與徐國良研究組合作首次建立了孤雄單倍體胚胎乾細胞，並證明這些細胞能夠代替精子使卵母細胞「受精」產生半克隆小鼠，不過該技術產生半克隆小鼠的效率低下（Yang et al., 2012, Cell）。2015年，李勁松研究組和楊力研究組合作，通過刪除兩個印記調控區域（Differentially Methylated Region, DMR）H19-DMR和IG-DMR，獲得了能夠高效產生半克隆小鼠的孤雄單倍體胚胎乾細胞（「人造精子」）（Zhong et al., 2015, Cell stem cell）。因此他們推測，「人造精子」介導的半克隆技術與BE3技術結合，有可能實現特定蛋白質關鍵氨基酸的在體遺傳篩選。

為此，研究人員首先在小鼠胚胎乾細胞系中，通過鹼基編輯器（BE3）的N端和C端同時加上一個核定位序列，建立了高效的單鹼基編輯系統。之後，他們將該系統應用於小鼠「人造精子」上，發現優化的BE3不僅可以在「人造精子」上實現高效的單鹼基編輯，將攜帶BE3的「人造精子」注入卵子還可以高效地產生純合點突變的半克隆小鼠。緊接著他們向「人造精子」中導入了一個靶向Dnd1基因的一個sgRNA慢病毒文庫（含77個sgRNA），發現能在半克隆小鼠中高效地誘導不同位點的單鹼基突變。通過兩輪的遺傳篩選，他們發現並驗證DND1的E59K、V60M、P76L和G82R對PGCs的發育具有重要作用。緊接著他們通過蛋白結構的預測、突變後蛋白的穩定性、蛋白與蛋白相互作用等多個層次分析發現這些位點對於DND1蛋白質穩定性和其與其它蛋白質相互作用起著關鍵的作用。

該工作在國際上首次利用鹼基編輯技術實現了個體水準蛋白質關鍵氨基酸功能位點的遺傳篩選，為蛋白質結構和功能的研究開闢了一個新的體系。該體系的另一潛在的重要應用是篩選人類疾病相關基因的功能位點，並與已有的SNVs資料庫進行比對，預測疾病相關基因的致病位點。

該工作在研究員李勁松和陳勇的共同指導下，由李勁松組博士生李慶和陳勇組博士後黎彥璟等完成。該工作得到了國家科技部、國家基金委、中科院B類先導專項以及上海市科委經費的支持，並得到了生化與細胞所GTP（全基因組標籤計劃）中心和動物實驗技術平台的支持。

圖：「人造精子」結合鹼基編輯技術實現蛋白質重要氨基酸的在體遺傳篩選

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