新冠病毒是如何在自然界發生重組？中國科學院西雙版納熱帶植物園在雲南新發現的另一種蝙蝠冠狀病毒，為中外科學家提供了解開這一謎題的新線索。
這一新發現的蝙蝠冠狀病毒的Spike蛋白的S1和S2亞部門的剪切位點處有多個氨基酸插入，揭示了新冠病毒（HCoV-19）的S蛋白S1/S2剪切位點的自然插入和新冠病毒的可能重組來源。S蛋白是新冠病毒與人類細胞受體ACE2結合的關鍵，相當於進入人體細胞的“鑰匙”。而上述剪切位點的插入此前被持陰謀論者的人認為是人工乾預。
以上科研成果來自中外聯合科研團隊，由山東第一醫科大學、山東省高等學校新發傳染病病因流行病學實驗室、中國科學院西雙版納熱帶植物園、中國科學院北京生命科學研究所、中國科學院武漢病毒研究所、中國科學院微生物研究所、澳大利亞雪梨大學聯合團隊的研究人員於當地時間3月5日發表在預印本網站bioRxiv上，論文尚未經同行評議。
在這篇論文中，研究團隊報告了一種新的蝙蝠來源冠狀病毒，命名為RmYN02，是在2019年5月至10月期間從中國雲南省收集的227隻蝙蝠的基因組分析中鑒定出來的。
研究顯示，RmYN02和新型冠狀病毒HCoV-19在全病毒基因組中的同源性為93.3%，在與HCoV-19最接近的1ab基因中的同源性為97.2%。相比之下，RmYN02受體結合域（RBD）與HCoV-19之間呈現低序列同源性（61.3%），可能不與血管緊張素轉換酶2（ACE2）結合。
然而，與HCoV-19相似，RmYN02的特點是在S蛋白的S1和S2亞部門的剪切位點處有多個氨基酸插入。研究團隊認為，這就有力證明了這種插入事件在自然界中是可以發生的。
這些數據表明，HCoV-19源於蝙蝠和其他野生動物中存在的病毒之間的多重自然重組。
該論文通訊作者為山東第一醫科大學基礎醫學院病原生物學研究所所長、山東省高等學校新發傳染病病因流行病學實驗室主任史衛峰，中國科學院微生物研究所病毒傳播預警與致病機制研究組組長、項目研究員畢玉海，中國科學院西雙版納熱帶植物園綜合保護中心景觀生態組組長、副教授Alice Catherine Hughes。
新冠病毒起源尚不明確，野生動物中仍有大量冠狀病毒
HCoV-19在中國及其他地區造成了前所未有的肺炎流行，已引起全球範圍的公共衛生關注。儘管蝙蝠被認為是HCoV-19最有可能的自然宿主，但病毒的起源仍不清楚。
論文中提到，在對疫情早期的幾例HCoV-19病例的流行病學調查顯示，大多數人在發病前曾去過武漢市華南海鮮市場，該市場有各種野生動物出售，最終已於2020年1月1日關閉。
系統發育分析表明，HCoV-19是一種不同於SARS-CoV和MERS-CoV的新型冠狀病毒。到目前為止，與HCoV-19最密切相關的病毒是RaTG13，它是中科院武漢病毒所石正麗團隊於2013年在雲南采集的一隻中華菊頭蝠標本中分離發現。RaTG13病毒株和新冠病毒具有96.1%的核苷酸同源性、92.9%的S基因同源性。這些數據再次說明蝙蝠是冠狀病毒的重要宿主。
然而，值得注意的是，香港大學公共衛生學院新發傳染病國家重點實驗室管軼教授、廣西醫科大學胡豔玲教授團隊，以及華南農業大學、嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室沈永義教授、肖立華教授團隊兩個研究小組此前均報告了存在於馬來穿山甲的HCoV-19相關冠狀病毒，這些穿山甲通過非法走私進入廣西和廣東。
研究團隊提到，儘管在全基因組水準上，這些穿山甲中檢測到的冠狀病毒與HCoV-19的距離要遠於RaTG13與HCoV-19的距離，但它們在S蛋白的受體結合域(RBD)上與HCoV-19非常相似。
因此，儘管目前還不清楚穿山甲是否是HCoV-19傳播到人過程中的中間宿主，但它們可能在冠狀病毒的生態學和進化中發揮重要作用。
他們認為，這些在穿山甲中發現的病毒可以表明，在野生動物中仍有大量的冠狀病毒樣本，其中一些可能直接參與了HCoV-19的出現。
HCoV-19和幾種代表性蝙蝠來源冠狀病毒序列比較。
一種新的蝙蝠來源冠狀病毒，命名RmYN02
論文中提到，2019年5月至10月,研究團隊從雲南猛臘縣的227隻蝙蝠中一共收集了302個樣本。這些蝙蝠屬於20個不同種類，大多數樣本從馬來菊頭蝠Rhinolophus malayanus（n=48, 21.1%）、中蹄蝠Hipposideros larvatus （n=41，18.1%）和小褐菊頭蝠Rhinolophus stheno（n=39,17.2%)中獲得。樣本來源於多種組織，包括翼膜（219）、肺（2）、肝（3）和糞便（78）。
除了3隻蝙蝠外，其余所有蝙蝠均為在活著時取樣並被釋放。
利用新一代宏基因組測序技術，研究團隊首先鎖定了2個初步的一致序列。這些序列產生的樣本來自於2019年5月6日至7月30日期間的11份馬來菊頭蝠糞便。經過一系列驗證步驟，研究團隊得到一個部分（23395bp）和一個完整（29671bp）的蝙蝠冠狀病毒基因組序列，分別命名為BetaCoV/Rm/Yunnan/YN01/2019 （RmYN01）和BetaCoV/Rm/Yunnan/YN02/2019 （RmYN02）。
相比之下，RmYN02與HCoV-19密切相關，表現出93.3%的核苷酸序列一致性，但從全長基因組層面來說，RaTG13和HCoV-19 的一致性更高(96.1%)。RmYN02和HCoV-19在大多數基因組區域(如1ab、3a、E、6、7a、N和10)非常相似（>96%序列一致性）。特別是，RmYN02在最長編碼基因區1ab (n=21285)與HCoV-19一致性達到97.2%。
不過，RmYN02和HCoV-19在S基因中的序列一致性（核苷酸71.8%，氨基酸72.9%）遠低於RaTG13和HCoV-19之間的97.4%。另外值得注意的是，RmYN02和HCoV-19在RBD中的氨基酸同源性僅為62.4%。而來自廣東的穿山甲冠狀病毒和HCoV-19在RBD中的氨基酸同源性為97.4%，也是在RBD區域目前和HCoV-19最接近的。
圍繞HCoV-19的同源模型、體外實驗和S蛋白的三維結構分析結果都表明，HCoV-19和SARS-CoV一樣，也可以利用ACE2作為細胞受體。研究團隊也同樣使用同源模型分析了RmYN02、RaTG13和兩個穿山甲CoVs的RBD。
RmYN02和代表性冠狀病毒RBD結構的同源建模和結構比較。
研究發現，RmYN02 RBD中的氨基酸缺失在受體結合位點附近形成了兩個比HCoV-19 RBD短的環。重要的是，在SARS-CoV、HCoV-19、RaTG13、穿山甲/MP789/2019、穿山甲/GX/P5L/2017的外子域（external subdomain ）
保守的二硫鍵在RmYN02中缺失了。研究團隊推測，這些缺失可能導致構象變化，從而減少RmYN02 RBD與ACE2的結合，甚至導致不結合。
當然也有可能的一種情況是，包括RmYN02、ZXC21和ZC45在內的環缺失的SARS相關冠狀病毒，使用了一種我們目前未知的受體。
值得一提的是，此前有研究認為，RBD中的6個氨基酸殘基(L455、F486、Q493、S494、N501和Y505)是HCoV-19與ACE2有效受體結合的主要決定因素。與同源建模一致，穿山甲/MP789/2019在所有6個位置上都具有與HCoV-19相同的氨基酸殘基。相比之下，RaTG13、RmYN02和RmYN01與HCoV-19均只在1個位置上有相同的氨基酸殘基。
研究團隊認為，這種進化模式是重組和自然選擇的複雜結合的表現。
系統發育樹：a 全長基因組；b、S基因；c、RBD ；d、RdRp(RNA依賴的RNA聚合酶)。
研究團隊還對RmYN02、RaTG13、HCoV-19和穿山甲中的蝙蝠冠狀病毒進行了系統發育分析。與先前的研究相符，穿山甲beta-CoVs形成兩個亞型。然而，論文中提到，穿山甲是否是這些病毒的天然蓄水池，或者它們從蝙蝠或其他野生動物中獨立獲得，這都需要進一步驗證。
更值得注意的是，在大多數病毒基因組中，RmYN02與HCoV-19的親緣關係最近，儘管這兩種病毒之間仍然有一段較長的分支距離。S基因樹顯示，HCoV-19離RaTG13較近，和RmYN02較遠，這表明後者在S基因經歷了重組。在RBD的系統發育樹上，HCoV-19和pangolin-CoV/GD最密切相關，與蝙蝠病毒都較遠，再次表明重組發生。最後，完整的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)基因(在RNA病毒的系統發育分析中經常被使用)系統發育分析顯示，RmYN02、RaTG13和HCoV-19形成了一個與穿山甲病毒完全不同的亞群。
HCoV-19是自然起源，可能通過重組獲得
類似禽流感病毒(AIVs)血凝素(HA)蛋白的方式，冠狀病毒的S蛋白在功能上分裂成兩個亞基S1和S2。而在某些AIV亞型的剪切位點上插入多鹼基氨基酸被認為與增強致病性有關。
值得注意的是，HCoV-19的特徵之一即為在S1和S2的交界處有一個四氨基酸的插入，這在其他β冠狀病毒的其他譜系中沒有觀察到過。這種被稱為弗林蛋白酶剪切位點的插入是HCoV-19獨有的，目前在所有檢測的HCoV-19序列中都發現存在。
研究團隊此番在RmYN02中S1和S2交界處也發現插入了三個殘基PAA，他們認為這是非常重要的。“雖然HCoV-19插入的殘基(以及由此產生的核苷酸)與RmYN02中的殘基不同，但可以表明它們是一個獨立的插入事件，它們在野生動物(蝙蝠)中出現強烈表明它們是自然起源的，可能是通過重組獲得的。”
因此，這些數據有力地表明了HCoV-19的自然起源。
此外，研究團隊再次確定了RmYN02的蝙蝠宿主為馬來菊頭蝠（Rhinolophus malayanus），和一種馬來菊頭蝠標本中獲得的序列（GenBank accession MK900703 ）100%一致。
馬來菊頭蝠和中華菊頭蝠都廣泛分布於中國西南部和東南亞地區。論文中提到，一般來說，這些蝙蝠不會長距離遷移，群居性很強，很可能生活在同一個洞穴中，這可能會促進它們之間的病毒交換和重組的發生。
值得注意的是，科學家從肛門拭子中發現了RaTG13，從糞便中發現了RmYN02。因此，糞便是是蝙蝠將病毒傳播給其他動物，特別是能夠利用洞穴環境的物種的一種簡單但可行的方法。
基於現有的數據，研究團隊認為，HCoV-19可能來源於野生動物中多種自然發生的重組事件。來自蝙蝠的病毒可能提供了HCoV-19的基因骨架，與蝙蝠或其他野生動物的進一步重組事件則導致獲得S蛋白、RBD和多鹼基剪切位點。
香港九龍灣馬來街興發大廈15樓D室