【乳腺癌術後患者】三氧治療對血清 TK1 水準變化的影響

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率呈上升趨勢，2015年女性乳腺癌新發病例約為2.32萬，死亡病例約為4萬，嚴重威脅著女性健康。現有的治療手段主要為手術切除、術後輔以放化療及內分泌療法。術後患者定期複查、監測並及時調整治療方案將有效改善預後。胸苷激酶1(thymidinekinase1，TK1)是一種與DNA合成及細胞增殖密切相關的關鍵酶，通過檢測腫瘤細胞增殖速度，在乳腺癌中有較高表達，並能對乳腺癌患者預後進行有效評估。

醫用三氧氣體是由三個氧原子構成的強氧化活性氣體，臨床可被用於多種癌症術後的輔助治療，因其刺激氧代謝，激活免疫系統，可能有效抑製腫瘤增殖，降低TK1水準。因此，本試驗利用酶免疫點印記化學發光法檢測三氧治療乳腺癌患者術前、術後TK1水準變化，比較患者治療前後腫瘤標誌物CA15-3及CEA的變化，並與雌激素受體(estrogenreceptor，ER)、孕激素受體(progesteronereceptor，PR)等進行相關性分析，探討TK1作為腫瘤細胞增殖標誌物在三氧療法對切除術後乳腺癌輔助診斷意義，並分析三氧療法對於乳腺癌患者的療效。

1標本來源

收集2015年8月至2016年8月暨南大學醫學院附屬復大腫瘤醫院女性乳腺癌患者血清標本104例，病理學檢查證實均為乳腺浸潤性導管癌。年齡39～66歲，中位年齡56歲;臨床分期參照美國癌症聯合委員會6(AmericanJointCom-mitteeonCancer，AJCC)乳腺癌TNM分期第7版:Ⅰ－Ⅲ期71例，Ⅳ期33例。所有患者行三氧治療前均獲手術切除，間隔時間平均為36個月。三氧治療前、後三個月內均未接受放、化療。同時收集健康體檢者血標本100例作為對照，對照組與治療組年齡、性別無統計學差異。上述標本收集均經本院醫學倫理委員會審批並同意。

2方法

外周血標本採集

於清晨空腹抽取無抗凝靜脈血3mL，以3000轉/min離心8～10min分離血清，分裝於兩個離心管，待檢。

TK1的檢測

測定步驟:把不同濃度的校準品按順序點樣到模板的A1、A2及A3位置上，每孔3μL，待檢血清按每孔3μL順序點在膜上後面的其他位置，室溫下自然晾乾約30～60分鐘至自然翹起。將膜放入反應盒內，用去離子水振搖洗膜2次，棄去洗液，加入配好的封閉液(3g封閉劑乾粉加50mL稀釋液)，25℃左右下振搖封閉30分鐘。棄去封閉液，按1∶500稀釋度加入抗TK1-IgY，25℃左右下振搖反應120分鐘。洗滌3次。按1∶500稀釋度加入生物素化IgY二抗，25℃左右下振搖反應40分鐘，洗滌同上。按1∶1500的稀釋度加入SA-HＲP，25℃左右下振搖反應60分鐘，洗滌同上。將ECL1和ECL2等量混合後過膜浸濕，精確反應1分鐘，放入壓膜透明膠片內，擠乾剩餘溶液，放入化學發光分析儀內，計時5分鐘，拍攝分析。產品說明書以0～2.0pmol/L為正常範圍，TK1＞2.0pmol/L預示存在增殖性疾病風險。

腫瘤標誌物的檢測

採用化學發光法，實驗步驟嚴格按照試劑盒操作說明書進行，CA15-3、CEA的正常範圍分別為(0-25)U/mL、(0-4.7)ng/mL。

1.三氧治療前乳腺癌患者與健康體檢組TK1水準的比較

104例乳腺癌患者TK1值平均值(1.52±1.53)pmol/L，與健康體檢組的(0.54±0.42)pmol/L相比，差異有統計學意義。

2.三氧治療乳腺癌患者前後 TK1 水準的比較

三氧治療乳腺癌患者前 TK1 值範圍為 0.01 ～ 5.38pmol/L，平均值為( 1. 52 ±1. 53) pmol/L，與三氧治療乳腺癌患者後 TK1 值比較，差異有統計學意義 。

3.乳腺癌患者不同臨床分期三氧治療前後 TK1 水準的比較

Ⅰ-Ⅲ期患者治療前 TK1 平均值為( 1. 05 ± 1. 17)pmol/L，治療後平均值為( 0. 38 ± 0. 44) pmol/L，差異有統計學意義( P ＜0. 05) ; Ⅳ期患者治療前 TK1 平均值為( 2. 53 ±1. 73) pmol/L，治療後平均值為( 1.47 ± 0. 94) pmol/L，差異無統計學意義。

4.不同臨床分期乳腺癌患者三氧治療前後腫瘤標誌物的比較

Ⅰ-Ⅲ期切除術後乳腺癌患者三氧治療前 CA15-3 陽性表達 9 例( 12.7%) ，CEA 陽性表達 10 例( 14. 1%) 。兩者在三氧治療前後比較，差異均無統計學意義( P ＞ 0.05) 。Ⅳ期患者三氧治療前有 CA15-3 陽性表達 23 例( 69.7%) ，CEA 陽性 26 例( 78. 8%) ，兩者在三氧治療前後比較，差異均無統計學意義。

5.乳腺癌患者 TK1 水準與 EＲ、PＲ 的關係

104 例乳腺癌患者中有 86 例ER、PR 雙陽性( n = 44) 和雙陰性患者( n =42) 。通過對 ER(-)PR(-) 和ER(+) PR(+) 乳腺癌患者三氧治療前 TK1 與ER、PR進行雙向無序 Spearman 相關分析發現，TK1 與ER、PR間有關聯 。

1關於TK1

TK1作為合成DNA的嘧啶補救途徑關鍵酶，與細胞的增殖密切相關，是異常增殖動力學標記物，腫瘤細胞TK1的表達明顯高於正常組織，其在正常組織中幾乎檢測不出。這一新的細胞增殖標誌物可用於健康體檢、腫瘤篩查、療效評價、監測和預後評估等並具有重要的臨床價值。在利用TK1對乳腺癌進行鑒別診治應用方面，有研究發現TK1表達在不同級別乳腺癌組織中存在差異，分級高者表達高，且TK1與Ki67表達有同一性。TK1在乳腺癌組織中高表達，對於導管原位癌的診斷具有較高的輔助價值。陳曲波等通過TK1對30例乳腺癌化療療效的應用價值進行了評估，其結果認為血清TK1水準可反映腫瘤細胞增殖，有望成為乳腺癌預後判斷及病情監測的重要指標。

2三氧的抗癌機理

根據中華抗癌協會乳腺癌診治指南與規範中提出的乳腺癌治療原則，當患者確診為乳腺癌後，手術後輔以放化療和/或內分泌治療等是常規治療手段。在術後無進展期或進展期，為儘可能地減少或延遲乳腺腫瘤再次複發或原處轉移的發生，臨床可考慮採用其它輔助療法。由於三氧療法一方面能提高紅細胞的氧含量，加快再氧合速度，增加再氧合細胞比例，解決乏氧腫瘤細胞對放射線或化療藥物的抗拒，清除放化療過程中形成的自由基，有助於身體的恢復。另一方面，三氧可刺激機體產生多種免疫活性因子，如各種內源性干擾素，白細胞介素，腫瘤壞死因子和轉化生長因子等，能誘導長期的抗腫瘤免疫，抑製腫瘤細胞的分裂與增殖，直接殺傷腫瘤細胞或誘導腫瘤細胞凋謝，抑製腫瘤血管生成。並且，國外有研究證實三氧可抑製體外乳腺癌細胞的增殖。因此，本研究特通過血清TK1水準對三氧療法治療乳腺癌的療效進行評價。

3Ⅰ-Ⅲ期患者效果明顯

在三氧治療前，本研究將104例乳腺癌患者TK1水準與健康體檢組進行了比較。結果發現差異有統計學意義(P＜0.05)，但總體乳腺癌患者TK1的平均值低於2pmol/L，處於正常圍。究其原因可能是施行原發腫瘤切除術後，大部分患者處於無進展生存期階段，體內無大量腫瘤細胞增殖有關。然而，總體TK1值仍遠高於健康人水準，並趨向風險值，因此，此結果仍有一定提示價值。另外，Ⅳ期乳腺癌患者術後TK1值為(2.53±1.73)pmol/L，高於正常範圍，提示存在增殖性疾病風險，與臨床分期具有一致性。

這位國外的乳腺癌患者在經歷過手術後，堅持做三氧大自血，一周做兩次，到今年為止已有17個年頭，雖然今年已經79歲了，但還保持著非常好的精神狀態。

其次，本文分析了三氧治療乳腺癌前後的TK1表達水準差異。結果發現:三氧治療後乳腺癌患者TK1水準顯著低於治療前(P＜0.05)，提示三氧療法能抑製TK1的增殖，可能使切除術後乳腺癌患者獲益。根據臨床分期進一步統計，Ⅰ-Ⅲ期患者經三氧治療後TK1值顯著低於治療前(P＜0.05)，提示獲益患者主要為Ⅰ-Ⅲ期患者，但Ⅳ期患者經治療後TK1值與治療前相比無統計學意義(P＞0.05)，表明Ⅳ期患者對三氧治療無明顯獲益。

4三氧抑製腫瘤細胞增值

為體現該療法對乳腺癌患者的治療效果，本文同時對治療前後腫瘤標誌物進行了統計分析，結果發現Ⅰ-Ⅲ期切除術後乳腺癌患者CA15-3和CEA陽性表達率低且均值位於正常值範圍，經三氧治療後，CA15-3和CEA水準總體呈下降趨勢，雖治療前後差異無統計學意義，但與TK1結果具有一致性。Ⅳ期患者CA15-3、CEA陽性率較高，治療後亦未見下降，提示三氧治療對Ⅳ期患者治療效果意義不大。但考慮在治療過程中，CA15-3、CEA亦未見顯著升高，結合TK1的檢查結果，不排除三氧治療控制乳腺癌腫瘤細胞增殖的作用。

已有研究表明，ER、PR為判斷乳腺癌預後好的相關因素。TK1陽性(＞134Du/L)與ER、PR雙陰性是乳腺癌患者術後複發的指標。本實驗中發現TK1與ER、PR中度相關(r=0.455，P＜0.05)，與陳曲波等報導ER、PR雙陰性乳腺癌患者TK1水準比ER、PR雙陽性患者高的結果基本一致，說明TK1與ER、PR聯合檢測能更好的反映乳腺癌患者的預後及進行療效評估。綜上所述，通過對血清TK1值的測定，可以推測三氧療法可能有效抑製Ⅰ-Ⅲ期切除術後乳腺癌患者腫瘤細胞增殖，控制疾病發展，然而，由於本次入組患者人數較少，有待進一步擴大研究人數驗證結果。