腫瘤細胞免疫治療之CAR-T技術（上）：技術優勢、風險與幾大應用場景

一、CAR-T技術原理

過繼性細胞治療是細胞的免疫治療一個主要研究方向。過繼免疫細胞輸注（adoptive cell transfer, ACT）屬於腫瘤的被動免疫療法，指的是分離腫瘤患者自體腫瘤浸潤淋巴細胞( tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)或者外周血淋巴細胞，在體外加以分選、擴增、活化，並回輸至患者體內。

在惡性黑色素瘤和腎細胞癌，TIL是常用的ACT治療。TIL是浸潤於腫瘤中的淋巴細胞，分離後在IL-2等因子作用下進行體外擴增，最後再回輸到患者體內。

然而，多數情況下無法應用TIL：有些患者缺乏腫瘤標本或腫瘤和轉移灶中TIL很少；獲得新鮮的腫瘤組織並分離和擴增TIL 具有難度；回輸的TIL 細胞功能受損，在體內往往不能有效識別腫瘤細胞; 腫瘤中強大的免疫抑製微環境降低回輸細胞的殺傷能力。

這些問題限制了TIL的廣泛應用，僅對如惡性黑色素瘤和腎細胞癌的少數腫瘤有一定療效，對大多數腫瘤療效欠佳。

在這種情況下，ACT需要使用外周血淋巴細胞。目前使用外周血淋巴細胞的ACT包括淋巴因子激活的殺傷細胞（lymphokine activated killer cells，LAK）、細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killer，CIK）、樹突細胞-細胞因子誘導殺傷細胞（dendritic cells-cytokine induced killer，DC-CIK）、抗CD3抗體誘導的活化殺傷細胞（anti-CD3 antibody-induced activated killer cells, CD3-AK cells）等。

然而CIK等是非特異性活化的淋巴細胞，缺乏腫瘤特異性反應能力。

在這種情況下，科學家開始通過基因修飾，將識別腫瘤抗原的T細胞受體（T cell receptor, TCR）或CAR基因導入淋巴細胞使之成為TCR基因修飾T淋巴細胞（TCR-T）或CAR-T細胞，使之具備腫瘤抗原靶向識別能力。

（二）CAR-T的治療過程

簡單來說，CAR-T治療過程為包括從病人外周血中分離淋巴細胞T細胞，通過基因載體將腫瘤抗原特異性CAR基因轉導入T細胞，生成CAR-T細胞，經體外擴增達到一定數量後靜脈回輸給患者。

由於被轉錄的CAR基因編輯的功能，回輸的CAR-T可以特異性結合癌症細胞，從而達到靶向治療的作用。

（三）CAR-T的結構

1.3.1 CARs結構總覽

CARs是靶向目標表面分子的重組受體，其結構主要包括胞外抗原結合域、跨膜區和胞內信號區三部分，對每個區域的不同設計影響CAR-T細胞功能的發揮。

1.3.2 胞外抗原結合域

胞外區源於單鏈抗體ScFv，由輕鏈和重鏈共同組成，負責抗原的識別。這種識別本質上是抗體與抗原的特異性結合，不需要依賴於MHC的遞呈，有效避免了腫瘤細胞MHC表達下調這一免疫逃逸機制。

CAR不僅能夠識別肽類抗原，還能識別糖類和糖脂類抗原，更加廣譜地殺傷腫瘤細胞。

目前已設計出的ScFv可識別抗原包括CD19、CD20、EGFR、Her2/neu、GD2、PSMA及RORI等。

1.3.3 跨膜區

跨膜區連接胞內區和胞外區，一般由二聚體膜蛋白組成，將CARs結構錨定於T 細胞膜上。

跨膜區的不同設計影響導入的CAR基因的表達能力。有文獻證實包含CD28的TM區的CAR表達能力最強，其次是包含OX40的CAR，而包含CD3ζ的CAR表達能力最差。目前設計用於CAR的TM區主要包括H2-Kb、CD4、CD7、CD8、CD28等。

1.3.4 胞內信號域

胞內信號域採用免疫受體酪氨酸活化基序( immune-receptor tyrosine-based activation motifs，ITAM) ，通常是 TCRζ（CD-3ζ）或FcRγ，當胞外區ScFv與其識別的抗原結合時，就會向胞內傳導 TCＲ 樣信號。根據胞內區結構不同，可將CAR-T分為四代。

1.3.5 CARs結構變遷

根據胞內區結構不同，CARs結構經歷了從第一代到第四代的變遷。

圖源：中國知網

第一代CAR只有一個胞內信號組份，主要是CD-3ζ或FcRγ。當第一代CAR受到特異性抗原識別並激發後，可為T細胞提供活化信號，並通過胞內結構域傳導該信號，引起細胞的活化，表現為CAR依賴的細胞活化及細胞殺傷作用，分泌穿孔蛋白、顆粒酶及細胞因子，協同作用殺死腫瘤細胞。

早期的實驗證明了CAR-T的可行性，是首次不依賴人類白細胞抗原進行T細胞激活的嘗試。然而，第一代CAR只能引起短暫地激活T細胞和分泌較低水準的細胞因子，不能提供長時間的T細胞擴增信號和持續的體內抗腫瘤效應。

為了解決這個問題，從第二代CAR開始引入了共刺激分子信號序列（costimulatory molecule，CM），如CD28、CD137（4-1BB）。與第一代CAR相比，第二代CAR含有一個活化結構域和一個共刺激區域，在保持抗原特異性一致的情況下，增強了T細胞增殖和細胞因子分泌的功能。

第三代CAR在前一版本上更新，胞內部分則由活化結構域和多重共刺激區域組成，具有三個胞內信號域，其中包括兩個串聯的共刺激域CD28、4-1BB或OX40和一個CD-3ζ。

這些結構域的增加不僅能夠加強CAR-T細胞特異性識別腫瘤抗原及結合等能力，更能夠顯著擴大由胞外區傳遞的細胞信號，引起下級細胞殺傷作用的級聯放大，抗腫瘤能力更強。

第四代CAR是最近出現的新型CAR，又稱TRUCKs ( fourth-generation CAR T-cells redirected for universal cytokine killing)。它的結構與前三代不同，引入促炎症細胞因子(如IL-12) 和共刺激配體( 4-1BBL 和CD40L) ，可以在具有免疫抑製性的腫瘤微環境中通過釋放促炎性因子，招募並活化更多的免疫細胞而引起更為廣泛的抗腫瘤免疫效應。

同時，第四代CAR的出現可使患者免受回輸前預處理治療（如全身照射或大劑量化療）的不良反應，減少回輸細胞總量，拓寬了CAR-T 細胞的臨床應用範圍。

（四）CAR-T的抗體結構

1.4.1 傳統抗體

圖源：Absolute Antibody

傳統抗體是分子量為150 k Da的四聚體多肽，由兩對相同的重鏈（50 k Da）和輕鏈（25k Da）多肽組成，二者由鏈間的二硫鍵鏈接，形成Y型或T型結構。

其中，輕鏈由N端的可變區（VL）和C端的一個保守的區域(CL)構成；重鏈由N端的可變區（VH）和三至四個恆定的區域（CH1,CH2,CH3,可能CH4）組成。

可變區的多樣性決定了抗體的多樣性與特異性，使得抗體具有結合特定抗原的能力。比較不同特異性抗體的VL和VH的氨基酸順序顯示，變異僅集中在其中少數區域的氨基酸上(15％～20％)，稱為超變區。

超變區是抗體的抗原結合位，與抗原決定簇的結構互補，故又稱為互補決定區(complementarity－determining regions，CDRs)。

胞外抗原結合域源於抗體的抗原結合基序，可以連接受體上的VH和VL區域，形成單鏈可變區scFvs，從而特異性識別腫瘤抗原。

1.4.2 納米抗體

駱駝和鯊魚類動物體記憶體在著天然缺失輕鏈的重鏈抗體，由體內兩條同源的重鏈肽段組成，相對分子品質為90 kDa。

如果克隆其可變區VHH，將得到隻由一個重鏈可變區組成的單域抗體，是目前可以得到的具有完整功能、穩定、可結合抗原的最小部門，又稱納米抗體，相對分子品質僅為15 kDa，僅為常規抗體的1/10左右。

納米抗體的VHH和人抗體重鏈可變區VH結構非常相似，其基因同源性達90%。納米抗體VHH表面大概只有10個氨基酸和人VH不同，其中在FR2位置有四個特異的氨基酸：普通抗體的FR2中V37、G44、L45和W47這4個氨基酸殘基是在進化中相當保守的疏水性殘基；而在VHH中，它們突變為親水性的氨基酸殘基F37、E44、R45、G47，增加了VHH的溶解性。

VHH的CDR1區和骨架區FR2存在半胱氨酸殘基(Cys)，可以和CDR3區中的Cys殘基形成二硫橋，增加了可變區的穩定性和結構變化。VHH的FR2區中特殊的親水性氨基酸殘基的改變和CDR3區二硫鍵的存在，也使得其穩定性和親水性也遠遠優於傳統的抗體。

VH 和VHH 結構示意圖

相比於傳統CAR-T，搭載納米抗體的CAR-T在性能上有更多優勢。

（五）CAR-T的基因修飾方法

穩定轉染是效應T細胞穩定表達CAR的前提。目前用於CAR-T的基因轉導的方法主要有逆轉錄病毒轉導、慢病毒轉導和mRNA轉染。

逆轉錄病毒科包含七個成員，其中γ-逆轉錄病毒已成為治療惡性腫瘤的臨床基因轉移常用載體。然而近年來，由於逆轉錄病毒轉導有引起插入致瘤的風險、不能感染非分裂細胞、病毒滴度低等問題，在臨床試驗中已經逐漸被慢病毒轉導所取代。

慢病毒載體含有順式作用元件中央多聚嘌呤區，因而慢病毒不受細胞分裂的控制，能夠在更廣泛的細胞類型裡進行有效的轉導，包括靜止細胞的轉導。

並且，慢病毒載體的整合位點更安全，轉基因負荷量更大，基因毒性更小。在靶向CD19的CAR-T臨床試驗中，慢病毒傳染的CAR-T顯示出更顯著的抗腫瘤效力。

當需要獲得短暫存在的CAR-T細胞時，則需要用到mRNA轉染。mRNA轉染是一種快速高效的轉染方式，T細胞在一周內瞬時表達，不能穩定持久存在，往往需要輸注大量的T細胞才能夠保證療效。

（六）CAR-T技術的優勢

總的來說，從原理、結構和製作工藝上，目前的CAR-T都比TIL和TCR更有優勢。

一、CAR-T細胞不受MHC限制，是抗原與抗體的特異性識別，能夠更加有效地殺傷具備抗原特異性的腫瘤細胞。而TIL和TCR均只能識別MHC提呈的抗原，可能因腫瘤細胞下調或突變其MHC分子而逃避免疫監視，臨床上有一定局限性。

二、CAR-T細胞療法使用劑量比TIL和TCR-T下降了2--3個數量級。由於CAR-T細胞治療靶點明確，具有高度識別腫瘤表面抗原的特異性，同時克服了 MHC限制性，因而在同樣的治療效果下，CAR-T療法的單次注輸細胞數量（1000萬-1億）遠遠少於TCR-T（10億-100億）和TIL（100億-1500億）。

三、CAR-T細胞療法所需時間更短。由於同等治療效果下CAR-T所需細胞數量更少，因而CAR-T培養T細胞所需時間最短。體外培育周期縮短至2周，大幅節約了時間成本。

四、CAR不僅能夠識別肽類抗原，還能識別糖類和糖脂類抗原，擴大了腫瘤抗原靶點範圍。出來不受MHC限制，CAR-T療法也不受腫瘤細胞的蛋白質抗原限制，CAR-T可以利用腫瘤細胞的糖脂類非蛋白質抗原，更能夠多維度識別抗原。

五、CAR-T具有一定的廣譜可複製性。由於某些位點會在多種腫瘤細胞中表達，如EGFR，針對這種抗原的CAR基因一旦構建完成，便可以被廣泛利用。

六、CAR-T細胞具有免疫記憶功能，能夠長期在體記憶體活。這對預防腫瘤複發具有重要臨床意義。

（七）CAR-T技術的風險與解決方案

1.7.1 脫靶效應（off-target toxicity ）

脫靶效應（off-target toxicity）是所有過繼性細胞免疫治療的共性問題，它的概念要和正常組織毒性（on-target toxicity）區別開。

正常組織毒性指基因修飾T細胞對同樣表達其靶點的正常組織的毒性。脫靶效應是指基因修飾T細胞對不表達這些靶分子的正常組織或器官的毒性。

如何鑒定出腫瘤細胞上合適的免疫原性的靶點，從而使得CAR-T細胞隻攻擊腫瘤細胞而不損傷正常組織，是CAR-T發展的關鍵。有一種做法是，通過設計多個抗原複合的CAR結構，識別抗原組合，能夠提高殺傷的特異性，如Wilkie實驗室使用同時靶向抗原ErbB2和MUC1的CAR-T治療乳腺癌。

1.7.2 細胞因子風暴( cytokine release syndrome，CRS)

當CAR-T細胞被回輸至體內，細胞治療過程中會釋放的大量細胞因子，包括 IL-6、TNFα 和 IFNγ，這些炎性介質促發急性炎症反應誘導上皮及組織損傷，導致微血管滲漏等機體多種免疫炎症反應，稱之為細胞因子風暴( cytokine release syndrome，CRS)。CRS發生於超過半數的CAR-T受試者，是最常見的不良反應之一。

CRS可發生於細胞輸注後2-3周，常見癥狀為發熱、寒戰、疲勞、低血壓、噁心、頭痛、心動過速、呼吸困難，以及心、肝、腎功能異常等。

CRS的發生於CAR的結構、腫瘤負荷及類型以及患者基因多態性相關，可通過設計安全的CARs並嚴格限制每次輸注的細胞數量來降低發生風險。

或者可導入一個安全開關控制基因，如可誘導的Caspase 9，當此基因被某種可溶性的因子誘導表達時，可引起 CAR-T細胞凋亡，有助於降低細胞的毒性反應。並且，當CRS發生後，也可利用托珠單抗等藥物進行治療、控制。

1.7.3 神經毒性

另一常見的不良反應為神經毒性。在成功利用托珠單抗治療CRS之後，神經毒性已成為CAR-T治療過程中的主要生命威脅事件，其發生機制仍有待探索。

多項臨床試驗曾報導包括腦梗死、譫妄、意識不清、抽搐、神經麻痹、視野缺損、共濟失調、言語障礙在內的多種神經系統異常癥狀。

美國Juno Therapeutics公司正是因其臨床試驗中出現5例不可預期的腦水腫死亡，而不得不宣布關停「火箭計劃」項目的臨床試驗。Juno分析推測神經毒性可能由預處理化療藥物氟達拉濱或CAR-T產品結構中的CD28共刺激結構域引起。

1.7.4 其他毒副作用

CAR-T尚有某些其他的毒副作用，如出凝血功能障礙、B細胞發育不良等。

其中凝血功能障礙主要表現為散在瘀斑瘀點、血栓形成及實驗室指標異常，如血小板減少、D-二聚體升高、纖維蛋白原降低、纖維蛋白降解產物升高、活化部分凝血活酶時間延長等。

B細胞發育不良則主要是因為針對腫瘤細胞的靶點（如CD19）同樣表達於正常B細胞表面，從而CAR-T細胞在清除腫瘤細胞的同時也會殺滅正常B細胞。

且CAR-T細胞可在體內長期存續和發揮作用，因此患者體內可長期缺乏正常B細胞，造成丙種球蛋白低下，易形成感染。因此患者需要適當補充丙種球蛋白提高免疫力作為預防措施。

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