中國科學家靶向編輯長壽基因 讓人類老弱血管“Q彈爽滑”

據說人體內的血管首尾相接長度可達10多萬公里，血液每天在其間奔跑，有的是“高速路”，有的是“國道”，有的又是“鄉間小路”。“新路”往往平滑順暢、暢通無阻，“老路”往往會坑坑窪窪、磕磕絆絆，有沒有可能通過生物技術的手段對“老路”進行修補呢？

日前，《細胞幹細胞》雜誌在線發表了中國科學院生物物理研究所劉光慧研究組、北京大學湯富酬研究組和中國科學院動物研究所曲靜研究組的聯合研究成果——通過靶向編輯單個長壽基因獲得首例遺傳增強的人類血管細胞。

“我們在人胚胎幹細胞中進行基因編輯操作，對編輯後的幹細胞進行定向分化，可在實驗室中獲得人類血管內皮細胞（血管內膜）、血管平滑肌細胞（血管中膜）及間質細胞（血管外膜）。”論文通訊作者之一的中國科學院生物物理研究所研究員劉光慧介紹，遺傳增強的人類血管幹細胞有望成為老弱血管“修補劑”，幫助修複衰老及受損血管，未來可能被應用於心肌梗死、缺血性中風等疾病的治療中。

腺病毒載體介導 選用“非主流”編輯器

提到基因編輯，CRISPR/Cas9技術名聲在外，它與ZFN、TALEN技術並稱為基因編輯“三大利器”。但此次選用的基因編輯技術卻並不是其中之一，而是被稱為輔助病毒依賴的腺病毒載體（HDAdV）介導的基因編輯技術。

這個一口氣讀不下來的名字需要拆分來理解。腺病毒載體是這款“基因編輯器”有效的核心，它能被細胞“吞”進去，並不會止步於細胞質，卻能夠進入到細胞核中，因為要對基因進行編輯、改寫、擦除等等操作，必須走進基因的“大本營”細胞核中。

然而腺病毒載體會保持在染色體外，並不整合進入宿主細胞基因組中，這樣不會對人類基因組造成損傷。

“我們使用的是第三代腺病毒載體，缺失了腺病毒的基因組序列，因此大大降低了病毒載體的毒性。”劉光慧說，可以理解為，經過技術改造，隻保留了腺病毒“裝卸貨”的功能，而它的病毒特性已經完全擯棄了。

當“HDAdV腺病毒號”貨車攜帶的DNA同源重組序列進入細胞核後，會自動完成基因組靶序列的搜索和置換工作。“HDAdV技術完全利用超大片段DNA同源重組的原理進行基因編輯，一般不會造成如CRISPR/Cas9一樣的脫靶效應。”劉光慧介紹，它可攜帶長達25—37kb的超長DNA片段進入人類細胞核，置換基因組的固有片段，進而實現高效精準的基因編輯。

技術越用越純熟，劉光慧研究組對HDAdV技術的應用研究已經積累多年。早在2011年，劉光慧等利用HDAdV基因編輯技術首次在人類疾病幹細胞中實現了致病基因突變的高效精準矯正。研究組研究生顏鵬澤接受採訪時表示，CRISPR/Cas9技術才剛剛問世、尚沒有在人類細胞中應用時，實驗室已經熟練利用HDAdV技術矯正或敲入了若乾種人類致病基因突變。同時也多番證明HDAdV基因編輯技術的安全性，相關文章發表於《自然》《科學》《細胞》和《細胞幹細胞》等雜誌。2017年，研究組更是通過HDAdV技術產生了國際上首例遺傳增強的人類間充質幹細胞。

編輯FOXO3基因 它是長壽界“名門閨秀”

工欲善其事、必先利其器。有了趁手的技術和精巧的技藝，要使得血管細胞“年輕化”，應該對哪段基因實施編輯呢？

“FOXO3是最保守的、也是公認的與長壽相關的基因。”劉光慧說，FOXO家族是一類轉錄因子，在上世紀90年代，科學家發現FOXO家族同源蛋白可能參與了動物壽命的調控。

隨著研究的深入，科學家們發現FOXO3基因與人類長壽的確相關。更進一步的研究精細到單個核苷酸。基本思路是，將百歲長壽老人群體的FOXO3基因與平均壽命78.5歲的老人對比，找到這個區域內的核苷酸變異，逐步縮小與長壽直接相關的位點範圍。更進一步的研究表明，許多國家地區的人在FOXO3基因中都能找到長壽相關的核苷酸變異。

研究組決定對FOXO3基因進行編輯，還由於它能發揮“一石二鳥”的作用。幹細胞應用於人體其實有著很高的難度，猶如平衡“蹺蹺板”，幹細胞的狀態必須恰到好處，如果太“瘋狂”可能成為腫瘤，如果太“弱小”有可能由於是外來細胞被機體消滅。

“研究發現，FOXO3具有維持血管穩態的功能。”劉光慧說，它本身是一個轉錄因子，能激活下遊的多個細胞保護的信號通路，FOXO3的活化還可通過誘導抑癌基因表達抵抗腫瘤形成，因此選擇FOXO3能同時提高細胞治療的效率和安全性。

為了證明這一點，研究組還將多種致癌因子導入了遺傳增強的血管細胞中，發現它也可以有效抵抗癌基因誘導的細胞惡性轉化，這大大降低了利用這些細胞進行治療的安全隱患，使得幹細胞向臨床應用邁向了堅實的一步。

是“節流”不是“開源” 調控細胞運轉“管理層”

FOXO3基因編碼的FOXO3蛋白，實質是一種轉錄因子。它的工作地點是細胞核內，通過與基因的特定序列專一性結合，保證基因表達“有秩序”“有規律”。形象地說，它們是細胞生命運轉中的“管理層”。

細胞內部對“管理層”也有“彈劾”制度。在一定狀態下，比如細胞感到“吃飽喝足”了，就會通過PI3K/AKT通路磷酸化修飾FOXO3蛋白，讓這種蛋白打上磷酸化的“標簽”，隨後這些FOXO3蛋白就被“奪權”了，活性被抑製，最終“下台”被請出細胞核。

“了解了這樣的調控機制，我們選擇了‘節流’而不是‘開源’。”劉光慧說，為了對基因組改動最小，研究組並不增強FOXO3基因表達，而是通過2個鹼基的置換保證FOXO3蛋白不被“彈劾”而且“連任”。

“我們使用HDAdV介導的基因編輯技術置換了人胚胎幹細胞中FOXO3基因的第3號外顯子中的兩個單核苷酸，使FOXO3蛋白轉錄因子不能有效地被AKT磷酸化，從而抑製了FOXO3蛋白的磷酸化和降解，促進FOXO3在細胞核內的聚集進而激活下遊‘有益’靶基因的表達。通過對人類基因組中的兩個核苷酸進行精準編輯，最大限度地保持了人類基因組的完整性。”劉光慧說。

經過基因編輯的幹細胞被定向分化為不同的遺傳增強型人類血管細胞後，進行了相關動物實驗。實驗表明，小鼠腿部大動脈血管處被人為結扎後，向腿部輸送血液的道路就被封住了。把遺傳增強的血管細胞注射到腿部後，與注入未經過遺傳增強的未經基因編輯的血管細胞的對照組相比，前者有著更強的自我更新、抵抗氧化損傷及延緩細胞衰老等能力，可高效促進受損血管再生，迅速恢復缺血部位血流。