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【指南速覽】二代測序技術在血液腫瘤中的應用中國專家共識(2018年版)

血液腫瘤是一類具有高度異質性的疾病,其診療需要結合形態學、免疫學、遺傳學和分子生物學進行綜合分析。二代測序(Next-generation sequencing, NGS)作為新的分子生物學技術,具有通量高、靈敏度高、成本低等優勢,是探索血液腫瘤的分子發病機制並指導臨床診療的重要手段。為推動NGS在血液腫瘤診療中的應用,提高診療水準,中國抗癌協會血液腫瘤專業委員會、中華醫學會血液學分會、中華醫學會病理學分會組織國內相關的血液、病理和檢驗專家,結合國外權威資料和已積累的大樣本數據,製訂了NGS在血液腫瘤中應用的中國專家共識。

血液腫瘤中常見的分子生物學異常主要包括基因突變、融合基因及基因異常表達。目前NGS在基因突變的檢測方面應用最為廣泛和成熟,本共識僅涉及基因突變的檢測。

NGS在血液腫瘤診療中的應用價值

1.診斷分型:

基因突變的檢測在急性髓系白血病(AML)伴重現性遺傳學異常、遺傳易感性髓系腫瘤、骨髓增殖性腫瘤(MPN)、骨髓增生異常綜合征伴環形鐵粒幼紅細胞(MDS-RS)、毛細胞白血病(HCL)和淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血症(LPL/WM)的診斷中具有關鍵性的作用,對於其他血液腫瘤則起到輔助診斷的作用。

2.預後判定:

基因突變是各類血液腫瘤預後判斷的重要依據,目前NCCN指南已提出了基於基因突變的AML預後分層體系。此外,MDS、MPN、MDS/MPN、急性淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤(CLL/SLL)、LPL/WM、大顆粒淋巴細胞白血病(LGLL)中,已經證實了一些具有明確預後意義的突變基因。其他血液腫瘤中突變基因的預後意義尚有待於進一步研究。

3.指導治療:

一方面,基因突變檢測可提供分子治療靶點,對應靶向藥物進行治療,目前已有基於突變基因的靶向藥物應用於臨床或處於臨床試驗階段,其中FLT3、IDH1/2、BRAF及JAK-STAT信號通路相關的突變基因已有靶向藥物上市;另一方面,基因突變可以導致對某些藥物的敏感或者耐受,及時檢測有助於治療方案的調整。例如,TP53突變的CLL/SLL患者對常規化療反應差,MYD88和CXCR4基因突變可影響伊布替尼在LPL/WM中的治療效果,ABL1激酶區突變是慢性髓性白血病(CML)和PhALL酪氨酸激酶抑製劑(TKI)耐受的主要機制之一。

4.微小殘留病(MRD)監測:

基因突變是MRD監測的分子標誌物之一。雖然實時定量PCR方法和流式細胞學是目前主流的MRD監測方法,但是由於NGS靈敏度隨測序深度加深可進一步提高,在MRD監測方面具有更大的優勢。

5.克隆演變:

血液腫瘤在發展過程中會伴隨動態的克隆演變,或是基因突變負荷的改變,或是新的突變基因的出現,及時監測基因改變,有助於了解疾病進展並調整治療方案。

基本流程

(一)檢測的基因種類列表設計

1.檢測的基因:

血液腫瘤相關檢測基因由臨床血液腫瘤專家和實驗室專家共同制定,主要依據中國抗癌協會、中華醫學會、WHO、NCCN等機構發布的血液系統疾病診療指南或者專家共識。對於其他權威文獻報導的重要基因,可在驗證之後納入基因列表。血液腫瘤易感的胚系突變基因,根據檢測需求可以納入,例如CEBPA、DDX41、RUNX1、ETV6、GATA2等基因除了可發生體細胞突變外,發生胚系突變可導致髓系腫瘤的易感。檢測基因的數量應在滿足臨床需求的基礎上,綜合疾病類型、實驗技術、樣本數量以及檢測成本達到最優化的設計。隨著基礎及臨床研究的不斷深入,檢測的基因種類亦需隨之更新。

2.檢測區域:

被檢測的基因所覆蓋區域可參考臨床診療指南、權威資料庫、文獻及實驗室自建資料庫等。首先應納入基因熱點突變區域或重要結構域的編碼區域,例如NPM1基因c.860_863為熱點突變區域,NOTCH1基因突變最多見於HD結構域及ΔPEST結構域;無明確熱點突變區域或突變位點分布比較分散的基因,應檢測全部外顯子,例如TP53、RUNX1等;剪接位點突變有可能導致外顯子跳躍,影響蛋白功能,建議根據資料庫記錄和文獻報導將剪接位點±5 bp的區域納入檢測範圍;對於存在非翻譯區(UTR)突變的基因,例如BCL6,則應納入相應區域檢測。需要注意的是,對於不能覆蓋的熱點突變類型或重要區域可通過其他檢測方法進行補充,並在檢測報告中明確說明。

(二)實驗流程

1.樣本採集:

疑診為血液腫瘤的患者,初診時應留存新鮮骨髓、外周血或組織樣本,以備進行NGS檢測,未留存者可使用初診時的骨髓塗片進行檢測。骨髓採集量以1~3 ml為宜,外周血採集量3~5 ml為宜,若白細胞計數偏高或偏低,應適當調整採集量,使單個核細胞總數達到1×107以上。抗凝劑首選EDTA抗凝劑或枸櫞酸鈉抗凝劑,禁止使用肝素抗凝,推薦24 h內4 ℃冷藏運送。福爾馬林固定後的組織標本需選擇腫瘤成分,切片厚度8~10 μm,5~8片為宜,常溫運輸。已染色標本不推薦進行NGS檢測。條件允許的病例,可從同一患者採取正常組織作為胚系突變對照。

2.DNA提取:

DNA品質是NGS檢測成功的關鍵因素,同一患者的不同病灶組織、不同組織切片應分別單獨進行DNA提取,並對DNA品質進行評估,包括濃度、純度和完整性分析。由於FFPE組織標本以及骨髓塗片所提取的DNA易片段化,且因保存環境及保存時間不同,導致DNA片段化的程度參差不齊,因此各實驗室應具有相應的方法檢測DNA的完整性或降解程度,並設立明確的合格樣本標準。

3.文庫製備:

文庫製備用於目標區域的富集,主要有雜交捕獲法和擴增子建庫法,無論採用何種方法制備文庫,均需使用已驗證過的建庫試劑。多標本同時測序應有相應的分子標籤用於區分不同的測序標本,明確不同的檢測標本和分子標籤的一一對應關係;必要時,可對加標籤的方法及試劑進行說明。文庫濃度過高會導致多克隆數據的產生,降低有效測序數據量;過低會導致整體測序數據的減少,因此在測序之前推薦使用實時定量PCR或其他方法對文庫進行定量,將文庫濃度調整至合適的水準。每個檢測項目應設定其文庫品質的要求,並設立明確的合格文庫標準。

4.上機檢測:

目前測序主要有電位檢測和光學檢測兩種基本原理,檢測DNA合成過程中釋放的氫離子或熒光信號。為保證測序品質、檢測區域覆蓋深度及報告時效性,需要根據樣本數量和品質選取適當的測序平台和晶元。

(三)生物資訊學分析流程

1.質控分析:

由測序平台產生的原始數據通常會存在鹼基召回錯誤、插入刪除錯誤、低品質讀段(reads)及接頭汙染等問題,會在一定程度上影響下遊的分析過程。因此,在對測序結果進行具體的生物資訊學分析之前,要先對下機數據進行品質評估,制定有效的品質控制標準,包括鹼基的品質Q20、目標區域平均測序深度、均一性等評價參數。血液腫瘤的基因突變檢測,測序深度應≥500×,平均測序覆蓋度、均一性以及在靶率均≥90%。

2.數據過濾:

低品質讀段會影響下遊的序列處理和分析,因此需要對測序數據進行過濾處理。數據過濾所針對的讀段主要有四種:測序品質低的讀段(low quality reads),重複讀段(duplicate reads),含有核苷酸的插入、刪除和替換等錯誤的讀段(insertion/deletion/mismatch)和帶有人工汙染的讀段(adaptor等)。常用的數據過濾軟體有Trimmomatic、Fastx_toolkit、NGS QC Toolkit等。

3.序列比對:

當讀段經過質控與過濾等步驟達到一定的品質標準之後,需要將其比對到參考基因組上。目前普遍參考的人類基因組參考序列為Human hg19。不同的比對方法根據不同的比對策略設計了不同的演算法,常用的比對程式軟體有MAQ、BWA、Bowtie/Bowtie2、SOAP/SOAP2、mrFAST和Stampy等,實驗室應當選取合適的比對軟體,建立完善的實驗室比對流程。

4.突變位點注釋:

突變位點識別常藉助於Samtools、GATK等識別工具。對突變位點的注釋內容包括功能資訊、頻率資訊、軟體預測結果資訊以及疾病資料庫資訊,常用的包括Ensembl、RefSeq、GENCODE、dbSNP、1000genomes、ESP、ExAC、COSMIC、HGMD、Clinvar、polyphen和SIFT等。

5.突變位點篩選:

篩選與鑒別疾病相關突變位點需要經過嚴格的篩選流程,至少需要排除低品質變異、未有明確意義的非編碼區變異、同義單核苷酸變異(SNV)及已知健康人群中的基因多態性位點。

(四)報告內容

1.基本資訊:

報告中除患者資訊、標本資訊、送檢日期、報告署名及日期等一般資料外,還應包括:檢測基因列表、檢測區域及突變類型;使用的檢測平台、目標區域的富集方法、平均測序深度、數據分析軟體名稱及版本號;對相關專業術語進行解釋說明;本實驗室報告突變位點的規則、檢測方法的局限性、檢測靈敏度和準確度等;註明是否通過其他方法補充了NGS未覆蓋或覆蓋不佳的檢測區域等。

2.突變位點的描述:

突變位點資訊應該包括基因名稱、突變的物理坐標、cDNA的轉錄本號、外顯子位置、符合人類基因組變異協會(HGVS)書寫規範的突變類型、氨基酸突變類型、變異等位基因頻率以及該突變位點的測序深度等。參考序列推薦使用美國國立生物技術資訊中心(National Center of Biotechnology Information)收錄的參考序列。當使用各基因編碼DNA參考序列描述突變時,推薦最常使用的經典轉錄本(canonical sequence)。

3.突變位點分級報告:

不推薦將良性或可能良性突變在報告中報導。建議突變位點根據臨床意義的明確性進行分級報告:

①一級變異:具有明確臨床意義的突變,包括:國家食品藥品監督管理總局(CFDA)、美國食品藥品管理局(FDA)等機構批準的用藥治療靶點;血液腫瘤診療指南或專家共識中有明確診斷、治療、預後意義的突變;尚未進入診療指南或專家共識,但有權威文獻或大規模報導在血液腫瘤中具有診療意義的突變。

②二級變異:具有潛在臨床意義的突變,包括:基於多個小規模研究報導在血液腫瘤中具有診斷、治療或預後意義,但尚未達成共識的突變;新發現的疾病相關基因重要結構域的體細胞突變。

③三級變異:臨床意義未明的突變,對於尚有爭議的突變位點,實驗室必須制定相關規則,可以發現突變即報告,並附上說明和意義;也可以不報告或隻報告小部分突變結果,並附上說明、參考文獻及資料庫。

4.報告解讀:

突變位點的臨床意義解讀要平實客觀、清晰易懂。推薦寫明突變位點的人群突變頻率、蛋白功能危害性預測和疾病資料庫的記錄,根據疾病診療指南、專家共識和既往研究說明突變位點在臨床診斷、治療和預後評估中的意義,註明其相關藥物及正在開展的狀態資訊,並附上資料庫和參考文獻來源。對於胚系突變,除了疾病診療指南及重要參考文獻外,推薦參考OMIM、HGMD和ACMG等資料庫或學術機構中遺傳疾病變異分類指導注釋臨床意義,並附上資料庫和參考文獻來源。陰性結果並不能完全排除患者不存在基因突變,可能是由於檢出靈敏度或檢測區域局限性所致,報告中應當以醫師可以理解的方式對此予以說明。

品質控制與管理

1.實驗室要求:

NGS檢測實驗室的總體設計與要求應參考《分子病理診斷實驗室建設指南(試行)》、《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》等行業文獻和要求。檢測人員、生物資訊分析人員、報告分析人員和提供顧問人員應具備相應專業背景且經過相應培訓取得上崗資質。實驗室區域設定和環境需要滿足實驗環節和儀器要求。NGS檢測試劑及測序平台應首選CFDA認可的產品。涉及實驗室自配試劑、探針等,應該有嚴格的試劑製備標準操作規程(SOP),並經過臨床實驗室自建項目(LDT)驗證合格後方可使用。

2.品質控制:

NGS實驗室應建立品質管理體系,對於標本採集和處理、實驗操作、生物資訊分析和報告分析各個環節均需要建立SOP檔案,實驗操作程式和生物資訊分析須經過性能驗證或確認。

表1 血液腫瘤相關突變基因的種類列表

註:橫屏或網頁版觀看效果更佳

AMLNPM1、CEBPA、RUNX1KIT、FLT3、NPM1、CEBPA、IDH1/2、TP53、RUNX1、ASXL1、DNMT3A、SF3B1、U2AF1、SRSF2、ZRSR2、EZH2、BCOR、STAG2FLT3、IDH1/2、NPM1、KITNRAS、KRAS、PHF6、WT1、CSF3R、PTPN11、ZBTB7A、KDM6A、DHX15、TET2、ASXL2、DDX41、ANKRD26、ETV6、GATA1、GATA2、SRP72、KMT2A、RAD21、SMC1A、SMC3ALL
IKZF1、TP53、NOTCH1、FBXW7ABL1、JAK3、JAK1NRAS、KRAS、FLT3、IL7R、SH2B3、BRAF、GATA3、ETV6、RUNX1、EP300、PAX5、RB1、JAK2、CDKN2A/BMPNJAK2、CALR、MPL、CSF3R、ASXL1、EZH2、TET2、IDH1/2、SRSF2、SF3B1JAK2、CALR、MPL、ASXL1、EZH2、IDH1/2、SRSF2、TP53、SH2B3、SF3B1、U2AF1、ABL1JAK2、CSF3R、ABL1DNMT3A、CBLMDSSF3B1、TET2、ASXL1、DNMT3A、SRSF2、RUNX1、TP53、U2AF1、EZH2、ZRSR2、STAG2、CBL、NRAS、JAK2、SETBP1、IDH1/2、ETV6ASXL1、EZH2、SF3B1、SRSF2、U2AF1、ZRSR2、RUNX1、TP53、STAG2、NRAS、ETV6、SETBP1、BCOR、FLT3、WT1、STAT3TET2、STAT3、TP53KRAS、PPM1D、GATA2、DDX41、PHF6MDS/MPNTET2、SRSF2、ASXL1、RUNX1、NRAS、CBL、SETBP1、ETNK1、PTPN11、NF1、KRAS、JAK2、JAK3、SF3B1、MPL、CALRASXL1、EZH2、SRSF2、SETBP1、BCOR、JAK3JAK2U2AF1、ZRSR2、TP53、ETV6B細胞淋巴瘤TP53、MYD88、BRAF、MAPK1、CXCR4、TCF3、ID3、BCL6、MAP2K1、NOTCH2、KMT2D、KLF2、SPENTP53、SF3B1、ATM、BIRC3、NOTCH1/2、KLF2、BCL6TP53、BTK、PLCG2、NOTCH1、SF3B1、BIRC3、MYD88、CXCR4、BCL6、BCL2TNFAIP3、CD79A/B、EZH2、ARID1A、MEF2B、PTEN、GNA13、B2M、CD58、CREBBP、EP300、FOXO1、KMT2C、CCND1、CARD11、PTPRDT/NK細胞淋巴瘤STAT3、STAT5B、ATM、JAK1STAT5BBRAF、KMT2D、KDM6A、ARID1B、DNMT3A、CREBBP、KMT2A、ARID2、TNFAIP3、APC、CHD8、ZAP70、NF1、TNFRSF14、TRAF3、TP53、FOXO1、BCORL1、TET2、IDH2、RHOA、CD28EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、BRCA1、BRCA2、TP53、CBL、KRAS、NF1、PTPN11、BLM

註:AML:急性髓系白血病;ALL:急性淋巴細胞白血病;MDS:骨髓增生異常綜合征;MPN:骨髓增殖性腫瘤

實驗環節需要設定陰/陽性對照。陽性對照一般採用包含已知突變資訊的混合樣本作為質控材料,並且其中應當包含最低檢測限的突變位點,實驗時同時進行檢測,以確保其檢出能力。陰性對照一般採用明確無突變或無核酸的樣本作為質控材料,實驗時同時進行檢測,以確保實驗過程中無汙染及無非特異性。

實驗室應定期參加相應檢測項目的室間品質評價或能力驗證;若無法實現,應通過與其他實驗室(如使用相同檢測系統的實驗室)比對的方式,判斷檢驗結果的可接受性。

樣本品質問題、檢測過程的不確定因素以及數據分析可能存在的漏洞,都可能導致檢測結果中存在假陽性或者假陰性。實驗室需要確定適宜的cut off值,在cut off值以上的結果可以採用自動化結果,但若出現比較疑似單鹼基插入或缺失的未知突變,建議進行人工核對,並採用Sanger測序、ARMS-PCR、數字PCR等方法進行驗證。而對於cut off值以下的有意義位點必須進行人工核對,同時採用ARMS-PCR、數字PCR或二次建庫/測序方法進行驗證。很多實驗室的NGS測序平台都可能會出現一定數量的"實驗室特異性"的突變,此類突變是該檢測系統特有的假陽性突變,應在報告時予以剔除。

3.資訊系統:

資訊系統的功能應滿足臨床需要,包括數據分析、存儲、傳輸及安全性等。生物資訊分析流程應包括所有的演算法、軟體、腳本、參考序列和資料庫,可以是內部的、供應商開發的或開源的。實驗室應有記錄NGS生物資訊分析步驟的書面程式用來分析、解釋、報告NGS檢測結果,且針對每份NGS病例數據分析報告,需要設立追溯機制,確保檢測中涉及的生物資訊數據分析流程能夠追溯。實驗室應規定原始序列核心數據的保存期限,並在醫師要求或患者檢測需要時,允許實驗室間重新分析、重新注釋及重新解釋。同時應確保NGS數據內部和/或外部存儲、轉移的保密性以及數據的完整性。

4.樣本管理:

檢測後剩餘的核酸樣品應盡量長期保存,以備必要時複查,同時也為開展科研工作提供條件。有條件的實驗室可建立自己的樣本庫,樣本庫的建立需按照相關規定進行,標本的資訊需完整,所有資訊須由專人負責,並完善各項書面記錄。

總結

隨著分子生物學在血液腫瘤發病機制和臨床診療研究的不斷深入,NGS在血液腫瘤中的應用將會越來越廣泛和高效。本共識闡述了NGS在血液腫瘤中應用的基本原則和總體流程,並對血液腫瘤的臨床診療提供有效幫助。NGS在未來的技術、分析內容和結果解讀方面會不斷進步和完善,在血液腫瘤的實踐應用過程中也會帶來各種挑戰。

委員會成員

參與共識討論的專家:哈爾濱血液病腫瘤研究所(馬軍、邱林);吉林大學第一醫院(白鷗);中國醫科大學附屬盛京醫院(劉卓剛、張繼紅);北京大學第一醫院(任漢雲);解放軍總醫院(高春記);北京協和醫院(陳傑、梁智勇、周道斌);中國醫學科學院阜外醫院(周洲);中國食品藥品檢定研究院(黃穎);中國合格評定國家認可委員會(周亞莉);衛生部臨床檢驗中心(彭明婷);北京大學腫瘤醫院(朱軍);北京大學人民醫院(秦亞溱);北京大學第三醫院(克曉燕);山西省腫瘤醫院(蘇麗萍);山西醫科大學第二醫院(楊林花、王晨);河北燕達陸道培醫院(劉紅星);河北醫科大學第二醫院(羅建民);空軍軍醫大學西京醫院(高廣勛、王哲);山東省立醫院(王欣);山東大學齊魯醫院(侯明、紀春岩);上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院(趙維蒞);海軍軍醫大學附屬長海醫院(楊建民、何妙俠);上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院(侯健);復旦大學附屬腫瘤醫院(杜祥);復旦大學附屬中山醫院(劉澎、侯英勇);江蘇省人民醫院(喬純、李建勇);蘇州大學附屬第一醫院(吳德沛、陳蘇寧);江蘇省臨床檢驗中心(許斌);南京大學醫學院附屬鼓樓醫院(樊祥山);徐州醫科大學附屬醫院(李振宇、桑威);安徽省立醫院(孫自敏);安徽醫科大學第一附屬醫院(曾慶曙);福建醫科大學附屬協和醫院(胡建達);廈門大學附屬第一醫院(徐兵);河南省腫瘤醫院(宋永平);鄭州大學第一附屬醫院(薑中興);河南省人民醫院(孫愷);華中科技大學附屬協和醫院(胡豫);華中科技大學附屬同濟醫院(周劍峰);武漢大學中南醫院(左學蘭);中南大學湘雅醫院(趙謝蘭);暨南大學醫學院血液病研究所(李揚秋);南方醫科大學南方醫院(劉啟發、梁莉);廣東省人民醫院(杜欣、翁建宇);深圳市第二人民醫院(杜新);南方醫科大學珠江醫院(李玉華);重慶醫科大學(丁克越);陸軍軍醫大學新橋醫院(張曦、郭喬楠);四川大學華西醫院(牛挺、劉衛平);陸軍軍醫大學西南醫院(陳潔平);四川省人民醫院(黃曉兵);重慶醫科大學第一附屬醫院(劉林);寧夏醫科大學總醫院(鄭波);青海省人民醫院(李文倩);雲南省人民醫院(楊同華);昆明醫科大學第二附屬醫院(周澤平);新疆維吾爾自治區人民醫院(王曉敏);海南省人民醫院(姚紅霞);天津市臨床檢驗中心(楊彬);天津市腫瘤醫院(張會來、李曉玲);中國醫學科學院血液病醫院(藺亞妮、張冬雷、朱平、魏輝、邱錄貴、肖志堅、王建祥、汝昆)


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