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【專家論壇】新一代測序技術在肺癌個體化醫療中的應用

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤,每年確診的肺癌病例約182萬,佔惡性腫瘤的13%,肺癌相關死亡約159萬例,佔癌症相關死亡的19.4%。根據病理類型不同,肺癌可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)兩大類,NSCLC約佔肺癌的85%。由於肺癌惡性程度高、起病隱匿,70%~80%的患者確診時已到晚期(Ⅲ/Ⅳ期),約60%的NSCLC在明確診斷後的1年內死亡。

目前肺癌的主要治療手段包括手術治療、放療、化療、分子靶向治療和多學科綜合治療。由於肺癌的異質性和多樣性,儘管這些年來在肺癌的診斷和治療方面取得了長足的進展,但肺癌的早診率和放化療有效率低,其5年生存率維持在15%左右。肺癌的異質性是抗癌藥物治療失敗的關鍵所在。不同肺癌患者可表現出不同的治療效果及預後,甚至在腫瘤患者的腫瘤病灶內也存在不同的細胞群體。因此肺癌的治療應對肺癌腫瘤病灶內的細胞或釋放至外周血的循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)進行分子檢測,尤其是對ctDNA的動態監測,以期提高治療效果、延長患者生存時間及改善患者生活質量。

隨著2003年人類基因組計劃的完成,基因測序技術不斷發展,進入了後基因組時代,新一代測序技術(Next generation sequencing,NGS)也逐步成為主流的測序技術,從科研走向了臨床,除了在腫瘤個體化醫療上有著廣闊的應用前景,在無創產前診斷、胚胎植入前遺傳性學診斷/篩查、遺傳病和藥物基因組中也發揮了越來越重要的作用。

一、新一代測序技術

自1980年英國生物學家Frederick Sanger與美國生物學家Walter Gilbert、Paul Berg建立了DNA測序技術並因此獲得了諾貝爾化學獎,至今已有近四十年。在這四十年裡,DNA測序技術取得了極大的進展。但是傳統的測序技術因其有限的測序通量和高昂的成本阻礙了基因測序分析技術的臨床應用。隨之而來的NGS的出現解決了上述不足。與一代測序相比,NGS可用於全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)、全外顯子測序(whole exome sequencing,WES)、RNA測序(RNA-Seq)和靶向測序等,同時因為其費用低,正逐步推廣至臨床應用。

(一)全基因組測序

WGS是對整個基因組進行測序的技術。它不僅提供了點突變、融合基因、插入缺失和拷貝數目變異的信息,同時還提供了染色體的重排、核苷酸重複序列和置換突變以及腫瘤整個基因組的結構重排等信息。隨著成本的逐漸下降,WGS已經成為不僅可以獲取最全面的基因編碼序列,還能輔助判定影響疾病發生發展因素的重要工具。研究證實,利用WGS技術對數量有限的細胞進行全基因組擴增的DNA配對測序是極為有效的,得到的測序數據結果與未擴增的基因組DNA相似。此外,WGS研究獲得的結果,可能有助於疾病的篩查、早期診斷及個體化治療策略的制定。

(二)全外顯子測序

全外顯子序列儘管在人類基因組序列中佔比僅約1%,但包含了人類85%的致病突變。WES具有針對廣泛應用領域的變異識別功能,可實現編碼區域的全面覆蓋,是發現突變體細胞的有效方法。目前WES已擴展至基因組的多個區段,包括外顯子、外顯子側翼區、啟動子、非翻譯區和miRNA基因的非編碼DNA。WES主要應用於生殖細胞突變(germline mutation),符合孟德爾遺傳規律缺陷的疾病;以及在體細胞突變(somatic mutation)相關疾病中也具有較大潛能。目前,WES已廣泛應用於疾病致病基因研究及疾病的基因診斷,尤其是腫瘤患者已知突變基因的診斷和新型突變的鑒定。與WGS相比,WES性價比更高,生成的數據集更小,分析更簡單快速,可提高突變信息的準確性。

(三)RNA-seq

RNA-seq是對通過反轉錄形成的cDNA文庫進行高通量測序,能夠全面快速地獲得大量高質量的轉錄本序列信息,從而進行基因表達序列差異分析。RNA-seq在融合基因、體細胞突變和基因表達譜分析方面具有較高的靈敏度和有效性。與微陣列技術相比,它也是一種更靈敏的檢測方法,可用於定量轉錄本的豐度,特別是那些表達較低的轉錄本。RNA-seq技術既可分析已知的基因,還可以檢測外源病原體轉錄物、未知的轉錄本和選擇性剪接物。通過RNA-seq對基因表達和轉錄組的變化進行實時監控,有助於了解哪些基因變異被表達,在疾病的診斷治療及預後評估方面具有重要意義。但RNA-seq目前面臨著:覆蓋範圍與成本之間的平衡、文庫構建和數據挖掘這三大挑戰。

(四)靶向測序

靶向測序通過對特異性區域進行測序,關注目標基因組區域,從而實現節約成本的精確化分析。靶向測序通常限於已知的相關變異。相對於WGS或WES來說,靶向測序技術成本明顯降低,檢測時間大大縮短;獲取的有效序列信息資料庫更小,數據分析簡便,同時能保證特定基因分析的準確性。因此靶向測序能快速而準確地檢測出疾病或表型相關的基因變異,有助於疾病已知基因的變異分析,但該方法的缺陷是忽略了未知的突變位點。

二、突變檢測

目前在肺癌個體化醫療中的應用

由於腫瘤的複雜性與異質性,基於單基因、部門點檢測已不能滿足個體化治療的需求,基於新一代測序技術的多靶點基因檢測是未來個體化治療的趨勢。大量研究表明,除組織樣本外其他類型樣本如外周血、胸腹腔積液等也可應用於NGS技術的檢測,這給無法取得組織樣本的中晚期肺癌患者帶來了福音。目前腫瘤NGS檢測主要針對體細胞突變,輔助腫瘤患者的分子分型、靶向治療藥物的選擇及預後判斷,使腫瘤個體化醫療得以真正實現。

(一)檢測NSCLC的突變類型

NSCLC存在大量的基因突變,常見的包括表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突變、KRAS突變及間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)融合基因等,這些基因的變化在腫瘤形成和腫瘤發展過程中均發揮重要的作用。致病基因突變或擴增的NGS檢測,為NSCLC靶向藥物治療提供了直接可靠的依據。

1EGFR突變:

EGFR/HER1基因與erbB2/HER2erbB3/HER3erbB4/HER4基因構成原癌基因家族,其表達的蛋白產物均位於細胞膜上,可共同構成一個複雜的網路信號,在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。若發生基因突變,細胞膜表面的EGFR的胞外區與配體結合後,傳導信號至胞內區,使得PI3K/AKTPLC/PKC等下遊細胞信號通路被高度激活,進而細胞發生惡性轉化。EGFR最常見的突變為外顯子19缺失以及外顯子21L858R位點的突變。同時研究也發現了少見敏感突變,如外顯子18突變、外顯子19插入突變、外顯子20插入突變等。研究表明NSCLC中EGFR的突變與人種有高度相關性,在東亞人群中EGFR基因突變率約為30%~50%,其中不吸煙亞裔女性肺腺癌患者EGFR突變率高達70%~80%。而在北美等西方人群中,突變率僅為10%~20%。早在2014年,全國肺癌和病理學領域專家共同制定了《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》,對標本的採集、處理、報告內容及周期等均進行了規範。2017年美國臨床腫瘤協會(ASCO)發布了臨床實踐指南更新,為EGFR突變的患者提供了臨床用藥指南,推薦使用阿法替尼、厄洛替尼或吉非替尼為一線藥物。

2ALK融合基因:

ALK是屬於胰島素受體家族的一種酪氨酸激酶,於2007年首次在NSCLC患者中被發現其可與人類棘皮動物微管相關樣蛋白4(echinoderm microtu-bule-associated protein like 4,EML4)結合,共同排列成一個具有致癌活性的EML4-ALK融合基因。EML4基因從染色體上斷裂,形成長短不一的外顯子片段,而該片段可與ALK基因第19、20外顯子之間融合,從而形成變異體。融合後EML4的啟動子可激活融合基因的轉錄和表達程序,表達的融合蛋白可導致細胞惡變。同時融合基因也可通過激活各種通路引起下遊細胞激活異常,從而刺激細胞的異常轉化。如調節細胞生存的JAK/STAT通路和PI3K/AKT通路和參與細胞增殖的RAS/ERK通路等。研究表明,ALK融合基因在不吸煙的年輕肺癌患者中高發,尤其是合併EGFR突變陰性的病例,ALK融合基因的陽性率高達30%~40%。

3ROS1融合基因:

ROS1是一個位於6號染色體q22區的原癌基因,同ALK一樣,是一種酪氨酸激酶,也同屬於胰島素受體家族,二者在氨基酸序列上高度相似。ROS1基因的重排常見於外顯子32~36區,重排後ROS1細胞外區丟失,而胞內區的酪氨酸激會持續處於活化狀態,從而促進腫瘤細胞的生長分化,加速腫瘤形成。在NSCLC中,ROS1的陽性率僅為1%~2%,並且常見於不吸煙的年輕患者中,與ALK相似。中國臨床腫瘤學會腫瘤生物標誌物專家委員會在2018版《中國間變性淋巴瘤激酶陽性、ROS1陽性非小細胞肺癌診療指南》中詳細描述了ALK陽性和ROS1陽性NSCLC的檢測,以及檢測的適宜人群、治療等方面,為肺癌的臨床診療工作提供了指導作用。

4c-MET基因擴增:

間質表皮轉化因子(c-mesenchymal-epithelial transition factor,c-MET)基因是位於7號染色體上的一種原癌基因,其編碼的蛋白產物為肝細胞生長因子受體(hepatocyte growth factor/scatter factor,HGF/SF),是c-MET酪氨酸激酶受體。c-MET蛋白本質是一種異二聚體,由α亞基和β亞基通過二硫鍵連接形成。其胞外區與配體HGF結合後,可引起自身激酶活化,並通過引起底物蛋白的磷酸化來激活細胞內RAS/RAF/MEK/ERKPI3K/AKT/mTOR等一系列信號轉導通路,促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。在NSCLC中c-MET的擴增可引起EGFR-TKIs的耐葯。而若NSCLC中發現c-MET基因高表達,則提示預後不佳。

5KRAS基因突變:

KRAS基因是位於12號染色體上的RAS家族的一種原癌基因,編碼的G蛋白家族,參與對細胞增殖、分化、凋亡等調控。當KRAS基因發生突變時,因無法正常傳遞細胞內信號,而引起細胞癌變。在NSCLC中,KRAS基因突變率在西方人群中最常見,高達30%,而在亞洲人群中僅為5%左右。KRAS基因在EGFR信號通路中起著至關重要的作用,位於通路下遊的KRAS像一個"開關" ,一旦KRAS基因突變,則多種分裂、增殖因子被持續激活,針對EGFR多種靶向藥物往往無效。KRAS基因突變的肺腺癌組織中,EGFR的表達顯著升高,而且兩者呈正相關。到目前為止任然沒有一個特效靶向藥物治療KRAS突變的患者,只能採用常規治療與靶向治療相結合的治療方式。

(二)分子靶向藥物耐葯問題

1EGFR-TKI耐葯:

EGFR-TKI是EGFR突變的NSCLC患者的一線治療方案。目前,EGFR-TKI藥物已由一代藥物發展為三代藥物。許多經過第一、二代EGFR-TKI治療的患者,在不到一年時間中均產生了耐葯,其最主要是由於EGFR基因20外顯子T790M突變,而針對T790M突變的。第三代EGFR-TKI藥物奧西替尼在2018版NCCN指南中,已由2類改為1類推薦。奧西替尼雖然明顯延長了患者生存期,取得了非常好的療效,但是上述耐葯問題依舊存在。研究顯示,耐葯的機制主要與EGFR的二次突變、旁路活化的激活及腫瘤細胞組織病理類型的轉變等密切相關。對於第三代EGFR-TKI耐葯的患者,尚無良好的解決方案。因此,開發下一代藥物,並採用聯合用藥等方式,降低不同藥物的不良反應,增加藥物治療效果,並結合放療、化療及免疫治療等手段,這還需要我們進一步探索,也是對醫學研究者的巨大挑戰。

2ALK-TKI耐葯:

第一代ALK-TKI藥物克唑替尼,是一種口服的抑製劑,不僅對c-MET有抑製作用,也可抑製ROS1的激酶活性,其可作為ALK重排陽性的NSCLC患者的一線用藥。第二代ALK-TKI藥物色瑞替尼在ALK陽性的NSCLC患者中有明顯的抗腫瘤效果;而艾樂替尼則在2017被NCCN列為治療ALK突變晚期的NSCLC患者的一類藥物。然而,第一代藥物應用的兩年內便出現耐葯現象,其本質是ALK基因的繼發突變,這極大地影響了ALK重排陽性的NSCLC患者的治療效果。在應用第二代ALK-TKI後,這些突變更為高發。研究表明,不同的ALK-TKI的耐葯機制不同,G1202R是二代抑製劑最常見的耐葯突變。而第二代藥物中艾樂替尼可抑製克唑替尼獲得性耐葯突變。

肺癌的治療方案已步入個體化治療時代。隨著NGS技術發展,靶向藥物不斷革陳出新,耐葯機制的研究也成為精準醫療發展中不可忽視的挑戰和機遇,需要我們科研人員更進一步探索。

三、NGS技術臨床應用存在的問題

目前,NGS技術常規應用於臨床檢驗中還存在著很多實際問題。NGS檢測比常規分子檢測複雜,實驗操作和後續生物信息分析均包含許多步驟。從樣本製備到數據分析過程中的每一步都可能出現錯誤,影響最終的測序結果。不同測序平台之間的結果缺乏可比性,這些充分反映了NGS檢測過程的複雜性以及制定統一實驗室操作流程和質量控制規則的迫切性。NGS產生海量的數據,需要進行龐大的數據分析。這不僅要求實驗室電腦具有較高的硬體配置,也需要專業的生物信息學者對數據進行深入挖掘。此外,完善的資料庫系統的缺乏也會大大增加運算工作的成本和時間。

NGS技術可以檢測出多個基因位點的突變,但大部分基因突變臨床意義尚未可知,真正能夠應用於臨床個體化治療的隻佔少數;已知基因突變位點如EGFR等突變率不高,覆蓋人群較小;且NGS技術檢測基因序列的改變,不能覆蓋轉錄及轉錄後水準的表觀遺傳學改變;目前,外周血測序的深度尚無統一的標準,在實際操作中,測序過深會導致假陽性的出現,測序過淺則難免出現假陰性。

四、肺癌個體化醫療的未來發展

2018年7月中國臨床腫瘤學會腫瘤標誌物專家委員會發表的《二代測序技術在腫瘤精準醫學診斷中的應用專家共識》以及10月中華醫學會檢驗醫學分會《液體活檢在臨床腫瘤診療應用和醫學檢驗實踐中的專家共識》的發布,使得NGS技術檢測必將走向規範化和標準化。隨著NGS技術不斷改進,高通量、長讀長的NGS將是未來的發展趨勢,隨著測序成本不斷降低、測序方法優化升級、數據解讀能力提高,報告解讀與質量控制等問題都將會得到解決。以針對外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)來源DNA的NGS分析以及腫瘤單細胞測序等下一代測序技術的開展,將彌補現有技術的不足,並逐漸成為臨床主要常規檢測項目的補充。

利用NGS技術檢測肺癌患者的ctDNA是當前肺癌個體化醫療的研究熱點。有研究發現肺癌患者循環中可檢測出ctDNA,且具有早期輔助診斷潛能。ctDNA水準與腫瘤負荷及分期相關,其半衰期短這一特點使ctDNA檢測可以更加精確地動態監測NSCLC患者治療過程中的腫瘤負荷變化,與傳統的基於影像學檢查技術相比,可及時對治療療效做出判斷,有助於檢測手術切除患者的殘餘腫瘤細胞及預測複發。

ctDNA NGS中檢測到基因變異的信息有助於腫瘤分子分型,同時ctDNA NGS作為NSCLC用藥伴隨診斷有助於患者個體化治療的靶向藥物選擇。目前用於指導NSCLC患者EGFR-TKIs靶向藥物選擇的ctDNA伴隨檢測試劑已獲得了FDA的批準,並寫入了NCCN指南。靶向藥物的使用往往會面臨著耐葯的出現,通過外周血ctDNA檢測可以得出循環中腫瘤分子的變化譜。研究表明ctDNA能夠比影像學更早地發現耐葯突變。

近年來,PD-1、PD-L1等為代表的免疫檢查點抑製劑在NSCLC的治療中取得了突破性進展,PD-L1與NSCLC抗腫瘤免疫反應負調控相關。由FDA批準的首個針對PD-L1靶分子的抗體藥物阿特珠單抗,在治療鉑類方案化療後疾病進展的轉移性NSCLC取得了顯著的效果。免疫治療成為新興的腫瘤治療手段,但目前PD-1/PD-L1免疫檢查點抑製劑缺乏好的療效預測指標,這就需要用NGS檢測技術方法,利用針對更多的特異性分子指標的檢測,提高腫瘤免疫治療療效判斷效率。

由於NGS現有技術的局限性,通過關注和引用其他檢測技術手段,如DNA甲基化等表觀遺傳學標誌物的檢測,將有助於推動肺癌的個體化醫療的進一步發展。利用DNA甲基化等檢測技術可以檢測與惡性腫瘤相關的轉錄及轉錄後的遺傳學改變,將在肺癌的早期診斷、分子分型、療效監測及預後判斷中發揮重要的作用,擴大腫瘤患者獲益人群。通過NGS檢測技術可以選擇合適的抗腫瘤藥物,藥物療效和毒副作用的即時檢測是腫瘤患者個體化治療的另一關鍵。而血漿中抑癌基因APC和RASSF1A甲基化和總血漿DNA聯合檢測,可為肺癌化療有效性和毒性的評估提供新的策略。這一無創、快速並同步觀察肺癌治療效果和毒副作用的技術,其準確率可達84.7%,方便臨床動態監測和隨訪。總而言之,眾多技術的聯合開展將有助於肺癌的個體化醫療的發展。

本文編輯:唐棟


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