奧希替尼聯合貝伐珠單抗治療伴EGFR T790M 突變肺腺癌的療效

目的： 通過移植瘤動物實驗探討奧希替尼泰瑞沙AZD9291聯合抗VEGF單克隆抗體靶向藥物貝伐珠單抗的療效及作用機制，為進一步臨床試驗提供理論依據。

方法：構建EGFR T790M突變的H1975人肺腺癌細胞移植瘤動物模型。

實驗分組：低劑量奧希替尼組、高劑量奧希替尼組、低劑量奧希替尼聯合貝伐珠單抗組、高劑量奧希替尼聯合貝伐珠單抗組。每組各5隻小鼠，給藥方法：奧希替尼2.5 mg/kg/d或5 mg/kg/d，採用每天灌胃處理；貝伐珠單抗5 mg/kg，每周2次腹腔注射。接種後和給葯期間繪製腫瘤生長曲線，給葯2周後處死裸鼠，活檢整個腫瘤。免疫組織化學SP法檢測腫瘤HIF-1α、VEGF和微血管密度（microvessel density，MVD）。應用Western blot法檢測EGFR及其下遊AKT和ERK信號通路蛋白的表達。

結果：給葯2周後，高劑量奧希替尼單葯組較低劑量奧希替尼單葯組腫瘤體積明顯縮小，HIF-1α、VEGF 表達率和MVD 顯著降低（P<0.05），p-EGFR、p-AKT 和p-ERK 表達減少（P<0.05）。低劑量奧希替尼聯合貝伐珠單抗組腫瘤體積明顯小於低劑量奧希替尼單葯組（P<0.05），上述因子均明顯降低（P<0.05）。低劑量奧希替尼聯合組與高劑量奧希替尼單葯組比較，腫瘤體積差異無統計學意義（P=0.178），p-EGFR、p-AKT、p-ERK表達差異無統計學意義（P>0.05）。高劑量奧希替尼聯合組與高劑量奧希替尼單葯組體積差異無統計學意義（P=0.642）。兩個聯合組之間，體積差異均無統計學意義（P=0.072），上述因子表達差異均無統計學意義（P>0.05）。

結論：貝伐珠單抗能夠顯著增加奧希替尼對伴EGFR T790M突變的肺腺癌移植瘤的殺傷能力。貝伐珠單抗與奧希替尼協同作用是通過降低腫瘤中VEGF表達，改善腫瘤微環境，增強抑製EGFR下遊信號通路激活而實現的。

關鍵詞：非小細胞肺癌 表皮生長因子受體 酪氨酸激酶抑製劑 抗血管生成治療 腫瘤微環境

肺癌是世界上發病率最高的惡性腫瘤，其中85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［1］。化療聯合抗血管生成靶向藥物可顯著延長非鱗型NSCLC患者總生存期（overall survival，OS）［2-5］。近年來，個體化分子靶向治療取得了巨大成功。對於EGFR敏感突變的NSCLC（外顯子19缺失［E19 del］和外顯子21點突變［E21 L858R］），採用第一代或第二代EGFR-TKIs治療，相比於傳統化療可明顯改善患者的預後。

AURA-3 Ⅲ期臨床研究顯示，既往使用EGFR-TKIs進展且存在T790M獲得性突變的患者，奧希替尼的客觀緩解率（objective response rate，ORR）鋼彈71%，中位無進展生存期（median progression free survival，mPFS）10.1個月［6］。

血管內皮生長因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）在血管發生中發揮重要作用，是腫瘤中內皮細胞存活所必需的。貝伐珠單抗能夠降低VEGF水準阻斷新生血管生成，瞬時正常化腫瘤迂曲的血管，改善腫瘤氧合併減少間質液壓力，以及恢復藥物到腫瘤中的遞送，這可能使腫瘤細胞對EGFRTKIs更敏感。JO25567Ⅱ期臨床試驗顯示，厄洛替尼聯合貝伐珠單抗較單葯厄洛替尼可顯著延長EGFR敏感突變NSCLC 患者的mPFS（16 個月vs. 9.7 個月），相比單純EGFR敏感突變患者而言，EGFR敏感突變合併T790M突變肺癌採用厄洛替尼聯合貝伐珠單抗一線治療PFS明顯延長（16個月vs. 10.5個月）［7］。

本研究通過構建T790M突變裸鼠肺癌移植瘤模型，採用奧希替尼聯合或不聯合貝伐珠單抗乾預，探討腫瘤微環境的改變對第三代EGFR-TKI 治療T790M突變肺癌的影響及相關分子機制，為進一步臨床試驗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

人肺腺癌細胞系H1975（EGFR E20 T790M）細胞株由四川大學華西醫院饋贈。實驗動物為SPF級雌性裸鼠BALB/C裸鼠20隻（4～6周齡，20 g左右），購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證編號SCXK（京）2014-0004。實驗獲醫院動物保護和應用委員會批準。

奧希替尼（AZD9291）購自美國Selleck公司；貝伐珠單抗購自瑞士羅氏公司，ECL Plus發光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配製試劑盒購自上海碧雲天生物技術有限公司。免疫組織化學SP超敏試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。CD34、VEGFA、HIF-1α抗體購於武漢博士德生物工程有限公司。EGFR、AKT、ERK及p-EGFR、p-AKT、p-ERK購於美國Santa Cruz公司，GAPDH抗體購自美國Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及裸鼠移植瘤模型建立

H1975細胞培養於RPMI 1640 培養基中（含10%胎牛血清和1%青黴素-鏈黴素），於37℃，5%CO2，90%濕度孵箱中培養，細胞貼壁。取對數生長期細胞，消化計數，2×106/mL細胞/隻接種於小鼠右後肢前方的側腹壁皮下。約1周後開始成瘤，接種後和給葯期間每周測量腫瘤體積至少2次。

在小鼠腫瘤長至平均為0.2～0.4 cm3時隨機分4組：A組（Low-O）：低劑量奧希替尼組（n=5，2.5mg/kg/d）；B組（High-O）：高劑量奧希替尼組（n=5，5 mg/kg/d）；C組（Low-OB）：奧希替尼低劑量聯合貝伐珠單抗給葯組（n=5，奧體替尼2.5 mg/kg/d，貝伐珠單抗5 mg/kg，每周2次）；D組（High-OB）：奧希替尼高劑量聯合貝伐珠單抗給葯組（n=5，奧體替尼5 mg/kg/d，貝伐珠單抗5 mg/kg，每周2次）。當腫瘤平均體積達到0.4～0.6 cm3（腫瘤體積V=L×W2×π/6）時開始藥物乾預。給藥方法：奧希替尼採用每天灌胃處理，貝伐珠單抗每周2次腹腔注射。接種後和給葯期間繪製腫瘤生長曲線，給葯2周後處死裸鼠，活檢整個腫瘤切取部分置於4%多聚甲醛溶液中，剩餘凍存於液氮中。

1.2.2 免疫組織化學檢測和判定標準

活檢組織於4%多聚甲醛溶液固定48 h後，常規脫水、石蠟包埋、切片，一抗採用兔抗鼠CD34、VEGFA、HIF-1α單克隆抗體，SP法免疫組織化學染色、最後DAB顯色，蘇木精復染，封片。常規光鏡觀察表達情況，每張切片隨機選取至少5個400倍視野，採用染色陽性細胞和染色強度雙評法［8-9］。未見陽性細胞者評分0分，陽性細胞比例≤10%者評定為1分，陽性細胞比例11%～50%者評定為2分，陽性細胞比例51%～80%者評定為3分，陽性細胞比例>80%者評定為3分；不顯色或顯色模糊者評定為0分，淺黃色者評定為1分，棕黃色者評定為2分，棕褐色者評定為3分。最終結果判定採用兩項相加：3分為弱陽性，4～5分為中度陽性，6～7分為強陽性，當陽性細胞比例<10%，不管顯色程度，均判為陰性。微血管密度（microvessel density，MVD）陽性判定：每張切片在100×倍鏡下找到3個染色血管最密集的區域，稱為熱點區域，在200倍鏡下計數熱點區域血管。每1個染成棕色，可與周圍血管、腫瘤細胞和其他腫瘤間質分開的內皮細胞或內皮細胞簇，均可作為單一計數的微血管。3個區域的均值為腫瘤的MVD值。

1.2.3 Western blot法檢測

分別將各組移植瘤標本在冰水浴中勻漿後裂解（加入蛋白酶抑製劑和磷酸酶抑製劑）提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度，5×上樣緩衝液混勻，煮沸3 min，迅速冰浴中冷卻，上樣量為每泳道30 μg，聚丙烯醯胺凝膠電泳後轉膜至PVDF膜，小牛血清蛋白封閉2 h，加入相應一抗4℃過夜孵育（GAPDH為內參）。洗滌後用二抗孵育，化學發光顯色，用image J分析各目的蛋白灰度值檢測及分析。

1.3 統計學分析

採用SPSS 20.0軟體進行統計學分析。數據採用x ± s 表示。各組腫瘤體積、各樣本灰度值、MVD、VEGF、HIF-1α表達比較均採用t 檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 移植瘤裸鼠腫瘤生長情況

實驗期間A、C、D組各有1隻裸鼠死亡，其餘裸鼠一般狀況良好，裸鼠移植瘤情況（圖1），各組移植瘤生長曲線（圖2），切除後各組移植瘤（圖3）。各處理組移植瘤裸鼠給葯前和處死後腫瘤體積變化情況（表1）。腫瘤細胞接種2.5周時（給葯前）各處理組之間腫瘤體積差異無統計學意義（P>0.05）。給葯2周後，奧希替尼聯合貝伐珠單抗給葯兩組腫瘤體積均顯著小於低劑量奧希替尼單葯組（P<0.05），低劑量奧希替尼聯合組與高劑量奧希替尼單葯組腫瘤體積差異不明顯（P=0.178）。高劑量奧希替尼聯合組與高劑量奧希替尼單葯組體積差異無顯著性（P=0.642）。兩聯合組間體積差異無顯著性（P=0.072）。

2.2 移植瘤裸鼠腫瘤組織中VEGF、HIF蛋白表達及MVD免疫組織化學結果顯示，VEGF表達在腫瘤細胞的胞質或胞膜，而HIF-1α表達在胞核（圖4，5）。奧希替尼聯合貝伐珠單抗給葯組VEGF和HIF-1α表達率較單葯組低（P<0.01）；兩聯合組之間VEGF 和HIF-1α表達率差異無統計學意義（P=0.348，0.830）；高劑量奧希替尼單葯組VEGF和HIF-1α表達率較低劑量奧希替尼單葯組低（P=0.012，0.008）。

聯合貝伐珠單抗給葯組MVD 較單葯組低（P<0.05），兩聯合組MVD表達率差異無統計學意義（P=0.453）；奧希替尼AZD9291單葯處理兩組中，高劑量單葯組較低劑量單葯組MVD低（P=0.026）。

2.3 各組EGFR及其下遊AKT和ERK通路蛋白表達

應用Western blot法檢測各處理組蛋白結果（圖陽性細胞比例51%～80%者評定為3分，陽性細胞比例>80%者評定為3分；不顯色或顯色模糊者評定為0分，淺黃色者評定為1分，棕黃色者評定為2分，棕褐色者評定為3分。最終結果判定採用兩項相加：3分為弱陽性，4～5分為中度陽性，6～7分為強陽性，當陽性細胞比例<10%，不管顯色程度，均判為陰性。微血管密度（microvessel density，MVD）陽性判定：每張切片在100×倍鏡下找到3個染色血管最密集的區域，稱為熱點區域，在200倍鏡下計數熱點區域血管。每1個染成棕色，可與周圍血管、腫瘤細胞和其他腫瘤間質分開的內皮細胞或內皮細胞簇，均可作為單一計數的微血管。3個區域的均值為腫瘤的MVD值。

1.2.3 Western blot法檢測分別將各組移植瘤標本

在冰水浴中勻漿後裂解（加入蛋白酶抑製劑和磷酸酶抑製劑）提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度，5×上樣緩衝液混勻，煮沸3 min，迅速冰浴中冷卻，上樣量為每泳道30 μg，聚丙烯醯胺凝膠電泳後轉膜至PVDF膜，小牛血清蛋白封閉2 h，加入相應一抗4℃過夜孵育（GAPDH為內參）。洗滌後用二抗孵育，化學發光顯色，用image J分析各目的蛋白灰度值檢測及分析。

1.3 統計學分析

採用SPSS 20.0軟體進行統計學分析。數據採用x ± s 表示。各組腫瘤體積、各樣本灰度值、MVD、VEGF、HIF-1α表達比較均採用t 檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

實驗期間A、C、D組各有1隻裸鼠死亡，其餘裸鼠一般狀況良好，裸鼠移植瘤情況（圖1），各組移植瘤生長曲線（圖2），切除後各組移植瘤（圖3）。

各處理組移植瘤裸鼠給葯前和處死後腫瘤體積變化情況（表1）。腫瘤細胞接種2.5周時（給葯前）各處理組之間腫瘤體積差異無統計學意義（P>0.05）。給葯2周後，奧希替尼聯合貝伐珠單抗給葯兩組腫瘤體積均顯著小於低劑量奧希替尼單葯組（P<0.05），低劑量奧希替尼聯合組與高劑量奧希替尼單葯組腫瘤體積差異不明顯（P=0.178）。高劑量奧希替尼聯合組與高劑量奧希替尼單葯組體積差異無顯著性（P=0.642）。兩聯合組間體積差異無顯著性（P=0.072）。

?A. Low-dose osimertinib group; B. High-dose osimertinibgroup; C. Low- dose osimertinib plus bevacizumabgroup; D. High-dose osimertinib plus bevacizumab group圖1 各處理組給葯2周後移植瘤圖6）。高劑量奧希替尼單葯組相比低劑量奧希替尼AZD9291組p-EGFR、p-AKT 和p-ERK 蛋白表達明顯降低（P<0.05）；奧希替尼聯合貝伐珠單抗給葯組p-EGFR、p-AKT和p-ERK表達較奧希替尼AZD9291單葯組明顯降低（P<0.05）；p-EGFR、p-AKT和p-ERK表達差異無統計學意義（P=0.089，0.381，0.590）；兩聯合給葯組之間p-EGFR、p-AKT、p-ERK蛋白表達差異無統計學意義（P=0.216，0.178，0.076）。EGFR、AKT、ERK在各處理組中表達差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

有研究提示，EGFR-TKIs 獲得性耐葯後腫瘤VEGF水準會升高，提出耐葯後腫瘤細胞對EGFR信號通路的依賴性會降低，而對VEGF 通路的依賴提高［10］。本研究顯示，EGFR信號通路依然是T790M耐葯突變肺癌細胞重要的生長依賴信號通路，奧希替尼AZD9291對EGFR 及其下遊PI3K/AKT/mTOR 和Ras-Raf-MAPK信號通路均有抑製作用，聯合貝伐珠單抗改善了腫瘤組織內的微環境，增強了這兩條信號通路的抑製作用，從而更有效地殺傷腫瘤細胞。

EGFR與VEGF相關信號通路均在腫瘤發生發展過程中發揮至關重要的作用。EGFR的異常激活導致腫瘤增殖加速且不受調控，VEGF信號通路與腫瘤血管生成相關。Folkman等［11］提出腫瘤血管生成依賴於激活「血管生成開關」，VEGFA是VEGF最常見的亞型，與VEGFR1，VEGFR2，NRPs（神經素）結合後，觸發並激活下遊信號通路，促進血管內皮增殖與遷移。VEGF也可引起微血管通透性升高，還可使循環內皮細胞前體、相關免疫細胞和間充質細胞聚集，在構建腫瘤微環境中發揮重要作用。Lichtenberger等［12］研究顯示，EGFR通路與VEGF通路存在「cross?talk」效應，兩者具有協同促進腫瘤生長的作用。

本研究觀察到，隨著奧希替尼AZD9291給藥劑量的增加，藥物抑瘤效果增強，而聯合VEGF抗體後，奧希替尼抑瘤作用也會增強。而從腫瘤生長曲線可以觀察到，貝伐珠單抗協同抑瘤作用較單藥劑量加倍抑瘤作用更顯著。提示適當劑量的奧希替尼聯合抗血管治療或許比單純增加奧希替尼劑量能帶來更大獲益。另一方面，這種聯合作用可以降低因為單一增加藥物劑量所造成的劑量限制性毒性，當然聯合貝伐珠單抗也會引起高血壓和出血等風險的增加。在實驗中，兩聯合組各有1隻小鼠死亡。需要注意的是，與低劑量奧希替尼組小鼠在實驗後期因為腫瘤負荷大所導致的死亡不同，聯合組小鼠死亡發生在貝伐珠單抗給葯後第3 d，不能確定是由於藥物本身引起還是由於實驗操作所導致。

本實驗中還觀察到，奧希替尼AZD9291聯合貝伐珠單抗組VEGF表達與微血管密度較奧希替尼單葯組減少，但奧希替尼聯合貝伐珠單抗組並未因為微血管密度降低而高表達HIF-1α。研究表明，HIF-1α能夠增強腫瘤細胞上皮間質轉化作用，重構細胞外基質，誘導耐葯，而且能夠增強腫瘤乾細胞活性，協助腫瘤細胞免疫逃逸的產生。本研究認為雖然貝伐珠單抗抑製了腫瘤新生血管生成，但卻改善了腫瘤內環境，進而改善了腫瘤組織內的供氧。這也符合Jain等［13］提出的在抗血管生成治療中出現的血管正常化現象：在1周以內，抗血管生成治療能使迂曲變形的血管變得更加正常，組織含氧量增加。但治療持續2.5周，遠超血管正常化的時間窗。Foster 等［14］認為，HIF-1αmRNA與蛋白合成並不僅僅依賴於氧，很大程度上依賴PI3K和MAPK通路。而高劑量奧希替尼組和奧希替尼聯合貝伐珠單抗治療組PI3K和MAPK信號通路被抑製，所以HIF-1α表達下降是可以解釋的。

觀察到奧希替尼AZD9291作用後能夠降低下遊活化的p-EGFR表達，影響PI3K/AKT/mTOR和Ras-Raf-MAPK雙信號通路。這與既往Cross等［15］在體內外實驗中對單葯奧希替尼作用機制的研究發現相一致。聯合貝伐珠單抗加強了這2條信號通路的抑製作用，這也從分子機制上解釋了聯合治療為什麼能夠帶來更多的腫瘤縮小。

綜上所述，本研究通過移植瘤動物實驗證實，第3代EGFR-TKI奧希替尼AZD9291對伴EGFR T790M突變的肺腺癌移植瘤具有很強的抑瘤作用，而貝伐珠單抗能夠顯著增加奧希替尼對伴EGFR T790M突變的肺腺癌移植瘤的殺傷能力，兩者具有協同作用。貝伐珠單抗與奧希替尼協同作用是通過降低腫瘤中VEGF表達，改善腫瘤微環境，增強抑製EGFR下遊信號通路激活而實現的。本研究為進一步臨床試驗提供理論依據。

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