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B肝在研新藥胞嘧啶鹼基編輯,在體外和體內,臨床前完整數據公布_cccDNA_HBsAg_降低

鹼基編輯技術公司Beam Therapeutics,最近在一次科學會議上展示了在研B肝新藥胞嘧啶鹼基編輯在體外和體內抑製B肝病毒複製並調降B肝表面抗原(HBsAg)表達的新數據,以下是該進展完整數據。

B肝在研新藥胞嘧啶鹼基編輯,在體外和體內,臨床前完整數據公布

Beam公司介紹,目前,HBV基因組作為遊離型共價閉合環狀DNA(cccDNA)在肝細胞中持續存在,它是慢性HBV感染的原因。同時,HBVDNA整合到人類基因組中並作為 HBsAg 表達的來源。已獲批標準療法(核苷(酸)類似物(NAs)逆轉錄酶抑製劑)可減少HBV複製,但還不能治愈,也不影響cccDNA和整合的HBVDNA的病毒蛋白表達(HBsAg)(Revill 等,2019)。

胞嘧啶鹼基編輯器 (CBEs) 可將 C-G 轉化為 T-A,而不會出現雙鏈斷裂。起始DNA序列與目標鹼基對(C:G)。胞嘧啶鹼基編輯器 (CBEs) 由脫氨酶 (綠色) 融合的部分失活的 CRISPR 蛋白 (灰色) 組成。引導RNA(gRNA)將 CBE 引導至目標基因組DNA序列,並暴露狹窄的編輯窗口。脫氨酶通過脫氨作用將胞嘧啶 (C) 化學修飾為尿嘧啶 (U),Cas酶在相反鏈上形成切口。尿嘧啶被DNA聚合酶讀取為胸腺嘧啶。修複有缺口的鏈,完成 C:G 到 T:A 鹼基對的轉換。

Beam的鹼基編輯B肝創新療法,旨在通過在HBV基因中引入終止密碼子,潛在功能性治愈HBV。用 CBE 靶向HBV基因組將允許在病毒基因中精確和永久地引入終止密碼子/錯義突變,而不會產生 DSB,從而最大限度地降低染色體重排/缺失風險。

鹼基編輯將使用相同的試劑來解決慢性B肝的兩個關鍵方面:其一是可通過在cccDNA中引入永久性突變來防止HBV反彈,其二是在沒有 DSBs 的情況下,不可逆地沉默整合HBVDNA中的 HBsAg 表達。設計了一種鹼基編輯方法,以針對HBV基因型D的保守HBV區域(用於建立大多數體外和體內HBV感染的臨床前模型)。使用 BE4 鹼基編輯器多路複用兩個 gRNA 同時降低 HepG2-NTCP 中的HBV參數:

兩個先導 gRNA 在HBV基因中引入終止密碼子,HBs (gRNA S1) 和 Precore (gRNA C2)(可見上圖)。結果表明,鹼基編輯器通過cccDNA編輯發揮作用,而不會降低cccDNA水準。相對於用靶向無關 PCSK9 基因的鹼基編輯試劑處理的對照樣品,鹼基編輯導致病毒細胞外(HBsAg、HBeAg)和細胞內(3.5kbRNA 和 HBV DNA)參數有效降低;BE4/gRNAs(S1+C2) 處理抑製所有 HBs 亞型,如在蛋白質印跡中觀察到的。

拉米夫定聯合治療導致B肝病毒標誌物的顯著降低,與 A 組類似。鹼基編輯不會降低 HepG2-NTCP 中的 cccDNA 水準 (E) NGS 對 cccDNA 富集樣本評估的編輯。用拉米夫定預處理可使 HepG2-NTCP 中的鹼基編輯率提高 20%。 Lam 預處理條件下的高 cccDNA 編輯表明 CBE 直接靶向 cccDNA。

鹼基編輯可防止 PHP 病毒反彈(可見上圖)。HBV DNA qPCR在原代肝細胞(PHH)上清液中評估的HBV複製。當停用拉米夫定會導致B肝病毒反彈,而使用鹼基編輯可防止B肝病毒反彈。鹼基編輯導致 HBsAg、HBeAg、HBVDNA,3.5kb RNA 的有效減少。NGS 對 cccDNA 富集樣本的編輯進行了評估:~55% 編輯 HBs 和~80% 編輯 PreCore 基因。

鹼基編輯從自然整合的 HBVDNA 中減少 HBsAg(可見上圖)。在 BE4 mRNA 和 gRNAS1* 轉染後第6天通過 ELISA 測定細胞外 HBsAg 水準。約 50% 的 HBs 基因編輯足以實現 HBsAg 的穩健降低。*gRNAS1 適用於匹配 PLC 細胞中整合的HBVDNA。

LNP 介導的 BE4 mRNA 和 gRNA S1/C2 的傳遞導致 HBV 小鼠模型中病毒標誌物的持續減少(可見上圖)。HBV 小環小鼠模型支持 HBV 樣病毒顆粒的持久產生和免疫活性小鼠中 HBV 抗原的表達(Yan 等,2017)。在流體動力學注射 cccDNA 樣小環質粒 4周後,小鼠接受一劑或兩劑(2x)鹼基編輯試劑(mRNA 和 gRNA 配製成脂質納米顆粒 (LNP),濃度為 2mg/kg);恩替卡韋 (ETV) 治療的小鼠口服 0.03mg/kg 抗病毒藥物兩周,然後停止治療;

評估鹼基編輯試劑在HBV小環小鼠模型中的抗病毒作用。 在第一次注射鹼基編輯試劑 BE4/gRNAs(S1+C2) 後第 35 天(6 周):平均 HBsAg 降低 > 2log; 6/9試驗小鼠的 HBsAg 降低至檢測限以下;HBV複製在恩替卡韋治療的小鼠中減少,然後在停用後立即反彈(陽性對照);在鹼基編輯治療組中,血清HBVDNA持續降低 >3 log;無HBV反彈;2次 LNP 注射可更好地降低血清HBVDNA;第一次 LNP 注射後兩周,所有試驗小鼠的 HBeAg 表達均低於檢測限。

綜上所述,研究人員對上述最新臨床前B肝鹼基編輯器結論:在HBV基因 HBs 和 Precore 中引入終止密碼子的兩個 gRNA 與 CBE 多路複用導致 HepG2-NTCP和 人類原代感細胞中的 HBsAg、HBeAg、HBVDNA和 3.5kb RNA 同時減少;在藥物作用機制(MoA)上,B肝病毒標誌物水準的減少似乎是由cccDNA的鹼基編輯驅動的,而cccDNA水準沒有降低;

鹼基編輯大大降低了自然整合的HBV序列產生的 HBsAg;在HBV小環小鼠模型中的體內 Poc 觀察到,靜脈注射 LNP 與 HBV靶向鹼基編輯器一起導致 HBsAg 持續降低,一些小鼠顯示 HBsAg 消失,以及 HBeAg 和血清HBVDNA的降低。綜合起來,這些臨床前數據表明,鹼基編輯可以通過引入突變消除HBV複製和沉默病毒蛋白表達,使cccDNA和整合的HBVDNA失活。

小番健康結語:昨天更新的是這種臨床前開發階段B肝病毒鹼基編輯器(CBEs)的核心結論與Beam公司的點評,今天更新的是這項臨床前新進展的完整動物試驗數據。綜合來說,Beam公司想要表達的觀點是,這種胞嘧啶鹼基編輯器在體外和體內模型中證明,既可以抑製B肝病毒複製,又可以降低B肝表面抗原的表達。返回搜狐,查看更多

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